en la década de 1960, se alcanzaron dos hitos en la fisiología de la absorción intestinal de azúcares. El primero fue la hipótesis del cotransporte de Na+-glucosa de Crane y sus colegas (1), que explicaba el transporte activo de azúcares, y el segundo fue el descubrimiento de la malabsorción de glucosa y galactosa (GGM) en pacientes (5, 6). La hipótesis del cotransporte ha sido probada exhaustivamente, confirmada y ampliada para incluir el “transporte activo” de una amplia variedad de sustratos en las células, desde la acumulación de lactosa en Escherichia coli hasta la acumulación de yoduro en la glándula tiroides. Esencialmente, los cotransportadores son máquinas moleculares que utilizan la energía almacenada en forma de gradientes de potencial electroquímico de iones a través de las membranas celulares, Na+ o H+, para impulsar la acumulación de solutos específicos y agua en las células (22). El cotransportador intestinal de Na+-glucosa (SGLT1) utiliza el Na+ y los gradientes eléctricos a través de la membrana para conducir el azúcar y el agua hacia los enterocitos en contra de sus gradientes de concentración (9, 13, 23). Tanto la glucosa como la galactosa son manejadas por el SGLT1, mientras que la fructosa es transportada a través del borde en cepillo por su propio transportador privado, el transportador de fructosa facilitado (GLUT5). La glucosa, la galactosa y la fructosa completan su viaje a través de la célula hacia la sangre a través de otro transportador de azúcares facilitado (GLUT2) en la membrana basolateral (Fig. 1).

La GGM se caracteriza por la aparición neonatal de diarrea acuosa y ácida severa, que es mortal en pocas semanas a menos que se elimine la lactosa (glucosa y galactosa) de la dieta (2). La diarrea cesa con el ayuno o la retirada de los azúcares ofensivos de la dieta, pero se reanuda rápidamente con la alimentación oral de dietas que contienen lactosa, glucosa o galactosa. La absorción de fructosa no se ve afectada. Dados los síntomas de la enfermedad y lo que se sabía entonces sobre la absorción intestinal de azúcares, se predijo que la GGM se debía a un defecto en el cotransportador de Na+-glucosa del borde en cepillo. Esta hipótesis se vio reforzada por los exquisitos experimentos autorradiográficos de captación de galactosa y de unión a la clorizina realizados en biopsias de la mucosa del primer paciente americano con GGM (17, 18). Estos experimentos demostraron que la reducción del transporte de galactosa se asociaba a una disminución del 90% de la unión de la clorizina al borde en cepillo. La clorizina es un inhibidor competitivo específico y no transportado de SGLT1.

La prueba diagnóstica más fiable para la GGM es la prueba de aliento H2 (Fig.2). La administración oral de glucosa o galactosa (2 g/kg) produce una elevación del H2 en el aliento muy superior a 20 partes/millón en los pacientes con GGM, pero no se produce tal aumento en los controles o en los pacientes alimentados con fructosa. Los niños con GGM prosperan “normalmente” con fórmulas de sustitución de la fructosa, pero los síntomas reaparecen incluso en la edad adulta con tan sólo una cucharadita de glucosa (6 g), y la prueba de H2 en el aliento sigue siendo positiva. La enfermedad es bastante rara. Conocemos unos 200 pacientes en todo el mundo, y una alta proporción de los casos proceden de relaciones consanguíneas.

La fisiología y la fisiopatología de la absorción intestinal de azúcares avanzaron en 1987 con nuestra clonación del cotransportador de Na+-glucosa de conejo mediante una estrategia novedosa que denominamos “clonación de expresión”. A este éxito le siguió rápidamente la clonación por Turk y Hediger (4) del cotransportador humano de Na+-glucosa y la identificación por Turk et al. (20) de la primera mutación en un transportador que causa una enfermedad genética, la GGM. Obtuvimos biopsias intestinales de dos hermanas diagnosticadas de GGM y muestras de sangre de los padres, que son primos. Turk et al. (20) identificaron una mutación homocigota sin sentido (Asp28Asn) en el ADNc de SGLT1 de cada hermana, descubrieron que cada uno de los padres era portador de esta mutación y demostraron que, efectivamente, la mutación abolía por completo el cotransporte de Na+-glucosa utilizando un ensayo de expresión de ovocitos. En la misma familia, se realizó posteriormente un cribado prenatal en dos fetos y se descubrió que uno (el hermano del probando) era portador de la mutación Asp28Asn y el otro (un primo) era normal. Ambos niños han prosperado sin restricciones dietéticas y han permanecido asintomáticos durante al menos dos años (11).

Los avances posteriores se vieron inicialmente obstaculizados por la dificultad de obtener muestras de biopsia de la mucosa de niños con GGM hasta que Turk et al. (21) consiguieron mapear todo el gen humano SGLT1. El gen es grande, con 15 exones distribuidos en 72 kb de ADN. Una vez que se secuenciaron los exones y sus regiones flanqueantes, se desarrolló un ensayo de polimorfismo conformacional de cadena simple para detectar mutaciones en los pacientes utilizando ADN genómico de una pequeña muestra de sangre. Este desarrollo implicó la amplificación por PCR de cada uno de los 15 exones y sus uniones intrón-exón y la electroforesis en gel de los productos de PCR desnaturalizados para identificar los exones portadores de mutaciones. A continuación se secuenciaron los exones anómalos. Para determinar si las mutaciones eran responsables del defecto en el transporte de azúcares, se expresaron los mutantes en ovocitos de Xenopus laevis para ensayos de captación de Na+-glucosa. Martı́n (Refs. 10, 12, y observaciones no publicadas) fue el principal responsable de esta fase del proyecto. Las mutaciones que explican la enfermedad fueron identificadas en 33 de los 34 pacientes con GGM examinados. Los pacientes de 17 familias tenían mutaciones homocigóticas y, en otras 10 familias, los pacientes tenían mutaciones heterocigóticas compuestas. Éstas incluían 22 mutaciones sin sentido (véase la Fig. 3) y 4 mutaciones de empalme y 3 mutaciones sin sentido que dan lugar a la producción de una proteína SGLT1 gravemente truncada. El hecho de que no se detectaran mutaciones en el 34º paciente puede deberse a que la mutación se encontraba en la región promotora del gen, y el ADN de esta zona no se incluyó en el procedimiento de cribado.

Como fisiólogo del transporte, me han interesado las mutaciones de sentido erróneo de GGM por su potencial para identificar residuos en la proteína críticos para el transporte. Por lo tanto, nos propusimos determinar cómo las mutaciones sin sentido causan realmente el defecto en el transporte de Na+-azúcar. En este enfoque, llevado a cabo en gran parte por Lostao (véanse las Refs. 10 y 12), se expresaron las proteínas mutantes en X. laevisoocytes y luego se utilizaron métodos biofísicos y bioquímicos para determinar el nivel de proteína en la célula y en la membrana plasmática. En los casos en que el transportador estaba insertado en la membrana plasmática, examinamos (7) las reacciones parciales del ciclo de transporte. En un principio, nos decepcionó comprobar que en los primeros 21 mutantes con sentido erróneo estudiados el defecto principal se debía a un tráfico erróneo de los transportadores en la célula. Sobre la base de los Western blots, todos los mutantes se sintetizaban a niveles similares o superiores a los del SGLT de tipo salvaje. Sin embargo, las mediciones de carga (7) y la microscopía electrónica de fractura por congelación (24) de la membrana plasmática del ovocito demostraron que había una severa reducción en el número de cotransportadores en la membrana plasmática (10, 12). A juzgar por el grado de glicosilación del núcleo y del complejo de los mutantes, el defecto en el tráfico de SGLT1 a la membrana plasmática se produjo entre el retículo endoplásmico y el Golgi o el Golgi y la membrana plasmática. El mal plegamiento de las proteínas mutantes puede ser la causa principal de la falta de tráfico del transportador (19). Sólo en un caso, Gln457Arg, la proteína mutante se encontraba en la membrana plasmática del ovocito cerca de los niveles normales.

¿Qué relevancia tienen estos experimentos en ovocitos para los intestinos de los pacientes con GGM? Para responder a esto, hemos examinado (datos no publicados) la distribución de la proteína SGLT1 mediante inmunocitoquímica en las biopsias de la mucosa de tres pacientes con mutaciones homocigóticas. En los tres, la distribución de las proteínas mutantes en el ovocito era idéntica a la distribución de SGLT1 en los enterocitos del paciente: en dos la proteína estaba en el citoplasma, y en uno la proteína estaba en el borde en cepillo. También hay concordancia entre nuestros resultados en los ovocitos y los obtenidos mediante estudios autorradiográficos de biopsias del primer paciente americano de GGM (18). Stirling y sus colaboradores (18) encontraron que la unión de la clorizina al borde en cepillo de la paciente estaba reducida en un 90%, y nosotros no encontramos ninguna proteína SGLT1 mutante (Cys355Ser y Leu147Arg) en la membrana plasmática del ovocito (10). Estos estudios sugieren que, al menos con estos cuatro mutantes GGM, el ovocito recapitula el comportamiento de la proteína mutante en el enterocito.

Una importante cuestión pendiente es cómo las mutaciones sin sentido distribuidas por toda la proteína (Fig. 3) perturban el tráfico del transportador a la membrana plasmática. Las respuestas a esta pregunta son importantes para comprender la biosíntesis de las proteínas de la membrana plasmática y para idear mejores terapias para los niños con GGM.

La mutación de GGM en un linaje, Gln457Arg, ha proporcionado una visión inestimable del mecanismo de transporte de azúcares. Lostao estudió (en preparación) el comportamiento de la SGLT1 Q457R expresada en ovocitos y en la mucosa intestinal del paciente y descubrió que la proteína se traduce, se glicosila y se inserta en la membrana plasmática, pero es incapaz de transportar azúcar. En ausencia de azúcar, la proteína mutante transporta Na+ por la vía de la fuga de Na+ o del unipuerto de Na+, y esto es bloqueado por la clorizina. La glucosa también es un inhibidor porque también bloquea esta vía de transporte de Na+, lo que indica que la glucosa se une al SGLT1 Q457R pero que no se transporta, es decir, la mutación produce un defecto de translocación del azúcar. Panayotova-Heiermann y sus colegas (15) demostraron de forma independiente que el “poro” de azúcar a través de SGLT1 está formado por el dominio COOH-terminal de SGLT1 que lleva el residuo Q457.

Para aprovechar estas observaciones hemos examinado el papel de Q457 en la translocación de azúcar. En este estudio, se descubrió que el mutante de cisteína Q457C mantenía una actividad completa de transporte de Na+-glucosa, aparte de un aumento de la constante de Michaelis-Menten (Km) aparente de la glucosa de 0,4 a 6 mM, y se descubrió que la mutagénesis química de Q457C con reactivos alquilantes cargados o neutros (metanosulfonatos, MTS) bloqueaba completamente el transporte de azúcar. Sin embargo, dado que la proteína Q457C alquilada se une a la glucosa con una constante de disociación muy similar a la Km aparente para el transporte de azúcar por el SGLT1 Q457C, este residuo no debe formar parte del sitio de unión del azúcar. La inhibición del transporte de azúcares por Q457C mediante MTS sólo se produjo cuando el cotransportador estaba en la conformación de Na+ orientada hacia el exterior, C2 (Fig.4). El reactivo no fue efectivo en ausencia de Na+, en presencia de Na+ y glucosa (o clorizina), o en presencia de Na+ a potenciales de membrana despolarizados. Los experimentos de salto de voltaje con Q457C marcado con rodamina también mostraron que el curso temporal y el nivel de fluorescencia seguían de cerca la transición del cotransportador entre las conformaciones C2 y C6 (Fig. 4). Interpretamos estos resultados como que el cotransportador puede existir en al menos tres conformaciones diferentes (C6, C2 y C3) y que el acoplamiento entre el transporte de Na+ y el de azúcar se produce a través de cambios conformacionales inducidos por el ligando y el voltaje en la proteína.

Los estudios preliminares con otras dos mutaciones GGM con sentido erróneo en el dominio COOH-terminal de SGLT1, A468V y R499H (Fig. 3), muestran que la sustitución de los residuos por cisteínas restablece el tráfico de la proteína a la membrana plasmática del ovocito. Ambas proteínas son funcionales, y el transporte de azúcares es bloqueado por los reactivos MTS. Como en el caso de Q457C, estos residuos son accesibles a los reactivos MTS sólo cuando las proteínas están en la conformación C2. Estos resultados apoyan mi opinión de que las hélices transmembrana 10-13 (Fig. 3) forman el poro de azúcar. Se necesitan más trabajos para identificar el poro de Na+.

En resumen, los estudios de biología molecular sobre el SGLT1 han llevado a la clonación del ADNc del SGLT1 humano y a la cartografía del gen, lo que ha proporcionado nuevas y potentes herramientas para examinar la fisiología del cotransporte Na+-glucosa y para estudiar la GGM. Se ha confirmado que la GGM se debe a mutaciones en el gen SGLT1, y la mayoría de estas mutaciones dan lugar a una proteína SGLT1 truncada o a un tráfico erróneo del transportador en la célula. Como se prevé para una enfermedad autosómica recesiva, una mutación privada produce la enfermedad en cada parentela y la frecuencia de la enfermedad aumenta en culturas con una alta frecuencia de matrimonios consanguíneos. Aunque la GGM es poco frecuente, es posible que el conjunto más amplio de individuos portadores de mutaciones leves en el SGLT1, o de mutaciones graves en un alelo, tenga alterada la absorción de glucosa y galactosa. Aproximadamente el 10% de la población normal, estudiantes de medicina, dio positivo en las pruebas de aliento de glucosa H2 (14). Esta interfaz entre la fisiología y la enfermedad no sólo ha aumentado la comprensión de la fisiopatología de la absorción de azúcar, sino que ha proporcionado nuevos enfoques para estudiar los mecanismos moleculares del acoplamiento entre el transporte de Na+ y de azúcar a través de las membranas plasmáticas.

PUNTOS PRINCIPALES

• * Primero de una serie de artículos invitados sobre Trastornos Genéticos del Transporte de Membrana.