Pufry s octanem amonným mohou v laboratoři způsobovat různé problémy. Mezi dva časté problémy patří překvapivé zvýšení protitlaku HPLC-MS při spuštění přístroje po nočním skladování a potíže s citlivostí MS.
Zvýšený protitlak přístroje při použití octanu amonného (a mravenčanu amonného) je častým problémem, který se vyskytuje na chromatografických fórech, zejména pokud přístroj stál přes noc nebo při prvních několika bězích každého dne. Vysoce rozpustné vodné pufry mohou způsobit mnoho starostí. Při praktickém použití se stávají problematickými, blokují kapiláry, předkolony a koncové frity analytických kolon.
Tyto problémy jsou vždy důsledkem nepochopení rozpustnosti pufrů ve smíšených organických vodných médiích. To lze překonat pomocí údajů uvedených na obrázku 1.
Obrázek 1: Rozpustnost pěti pufrů ve směsích s acetonitrilem. (Převzato se svolením z Ref. 1)
Obrázek 1 jasně ukazuje, že rozpustnost octanu amonného v binárních směsích obsahujících nad 90 % acetonitrilu je stále omezenější a ve 100% acetonitrilu je zcela nerozpustný. Zatímco 20mM octan amonný je hranicí rozpustnosti při 90% acetonitrilu, při 95% acetonitrilu tato hranice prudce klesá na 10mM octan amonný (oblíbená koncentrace pufru používaná v aplikacích LC-MS). Překročení těchto mezí rozpustnosti má za následek zakalení kapaliny v důsledku jemné sraženiny octanu amonného v roztoku. Ten může zablokovat kapiláry a fritové kolony a způsobit zvýšení protitlaku v systému. Je třeba také poznamenat, že údaje z obrázku 1 jsou odvozeny za použití vysoce kvalitního pufru – rozpustnost se sníží, pokud se použijí činidla s nižší kvalitou (čistotou) pufrových solí. Nepokoušejte se rozpouštět acetát amonný v čistém acetonitrilu, i když se pak do roztoku může přidat voda. I když se zpočátku může zdát, že je pufr rozpustný, rychle z roztoku vypadne (Obrázek 2).
Obr. 2: Zbytek octanu amonného vzniklý při “rozpouštění” octanu amonného v acetonitrilu s následným přidáním vody, aby se dosáhlo požadovaného poměru organické a vodné složky eluentu (Fotografie s laskavým svolením dr. Paul Ferguson, Astra Zeneca, Velká Británie).
V typickém gradientu HPLC s obrácenou fází to možná není takový problém, pokud ovšem váš gradient nepřechází na >90% acetonitril. Existují však i další úvahy, například relativní procento organického rozpouštědla, s nímž se může vodný pufr setkat při míchání pomocí nízkotlakých nebo vysokotlakých míchacích systémů, při vstřikování vzorků rozpuštěných ve vysokém procentu acetonitrilu nebo, v nejhorším ze všech případů, při proplachování systémů 100% acetonitrilem za účelem odstranění kontaminantů z kolony nebo při nočním skladování.
Při použití 100% acetonitrilu pro skladování kolony je dále třeba vzít v úvahu, že ve 100% organickém rozpouštědle může dojít k velkým posunům pH, a je třeba mít na paměti, zda tyto posuny pH nemohou vést k tomu, že se pH při skladování kolony dostane do rozmezí, ve kterém může dojít k rozpouštění matrice oxidu křemičitého, což povede k tvorbě “jemných částic” v koloně, které v konečném důsledku povedou k zablokování kolony (při vysokém pH) nebo k odstranění ligandů vázané fáze (při nízkém pH).
Octan amonný jako pufr
Mnozí se rozhodli použít jako pufr octan amonný, zejména při použití MS detekce, vzhledem k jeho přirozené těkavosti a nízké náchylnosti ke kontaminaci zdrojů API. Mějte však na paměti tuto omezenou rozpustnost a přizpůsobte tomu naše postupy HPLC. Uvědomte si, zda je použití octanu amonného pro daný experiment vhodné a zda je pufr skutečně nezbytný. Požadavky na použití a vhodnou volbu a koncentraci pufru jsou často špatně chápány. Příkladem pro zkoumání použití a nesprávného použití tohoto velmi oblíbeného pufrovacího systému je octan amonný.
Pufry jsou nutné, aby odolávaly malým změnám pH (především eluentu) a aby zajistily, že HPLC kolona zůstane ve stavu konstantního náboje (především stav ionizace zbytkových silanolových forem na povrchu křemíkového nosiče). Změny pH mohou způsobit problémy se stabilitou retenčního času, tvarem píku a (při použití elektrosprejové MS) citlivostí přístroje. Největší “problém” pro pH systému obvykle představuje mísení ředidla vzorku s eluentem ve spojovacích prvcích mezi injektorem a HPLC kolonou (nebo předkolonou) a v hlavě kolony. Pokud má ředidlo vzorku jiné pH, pak může analyt (nebo část molekul analytu) změnit ionizační stav a chromatografovat jinak nebo v důsledku toho reagovat jinak v MS rozhraní. Je však důležité porozumět chemii naší analytické metody, abychom mohli učinit rozhodující volbu typu a koncentrace pufru. Koncentrace analytu a množství povrchu kolony vyžadující regulaci pH jsou natolik nízké, že k zachování reprodukovatelných retenčních časů, přijatelného tvaru píku a citlivosti detekce stačí jen velmi nízká koncentrace pufru.
Obrázek 3 ukazuje situace, ve kterých může být octan amonný užitečný jak v chromatografii, tak v hmotnostní spektrometrii.
Obrázek 3: Změna kapacity pufru pro vodný roztok octanu amonného (10 mM) s různými podíly acetonitrilu (%) (Převzato se svolením z Ref. 2)
Při přidání 10mM octanu amonného do našeho elučního roztoku a použití zředěného amoniaku nebo kyseliny mravenčí k úpravě pH existují v podstatě dvě oblasti pufrování. Bez přídavku kyseliny nebo zásady bude mít roztok velmi malou pufrovací kapacitu.
V 100% vodném roztoku se hodnoty pKa pufru pohybují kolem 4,8 a 9,5.
Přidáním kyseliny nebo zásady se roztok stane pufrovaným. Pufr je nejvhodnější používat přibližně +/- 1 jednotku pH od pKa pufru, kdy se pufrovací kapacita sníží na přibližně 66 %. Při odchylce 2 jednotek pH od pKa pufru se pufrovací kapacita sníží přibližně na 5 %. Pro pufr octanu amonného ve vodě by pH eluentu použitého k separaci mělo být 3,8 až 5,8, pokud se jako modifikátor pH použije kyselina mravenčí, a 8,5 až 10,5, pokud se k úpravě pH eluentu použije amoniak. Upozornění: jakmile se do systému přidá acetonitril, tento pracovní rozsah se změní a použitelný rozsah pH se změní na 5,2 až 7,2 nebo 7,9 až 9,9 při 60 % acetonitrilu. U gradientových separací se bude pKa pufrového systému neustále měnit. K odhadu použitelnosti pufru pro separaci se používá pKa systému při výchozím složení gradientu.
Budou tyto rozsahy pH dostatečné, aby se zabránilo změnám rozsahu ionizace analytu nebo změnám protonizace kolony? To je klíčová otázka.
Pro MS detekci povedou ionogenní analyty v ionizované formě k dobré citlivosti detekce, přičemž se podaří zvládnout retenci v obrácené fázi díky uvážlivé volbě stacionární fáze a typu a složení organického rozpouštědla. Pokud je analyt plně ionizován v rozmezí pH navrženém výše (a na obrázku 3), pak bude výsledkem dobrý chromatografický a detekční výkon. Všimněte si na obrázku 1, že pufrovací kapacita systému se snižuje s přidáváním acetonitrilu, přičemž pufrovací kapacita klesá na 30 % vodné hodnoty při 60 % acetonitrilu. Klíčovou zásadou při použití pufru v LC-MS je použít co nejmenší množství, aby byla zachována reprodukovatelnost retenčního času, přijatelný tvar píku a citlivost detektoru. Koncentrace pufru přímo ovlivňuje míru potlačení iontů, ke kterému dochází, a tím přímo ovlivňuje citlivost metody. Pro zachování dobré pufrační kapacity při nižších koncentracích pufru se často snažíme pracovat v rozmezí +/- 0,5 jednotky pKa pufru.
Tabulka 1 uvádí doporučené rozsahy pH, ve kterých budou užitečné pufry s octanem amonným.
| % MeCN | Maximální rozsah kapacity pufru (kyselina octová / acetát) | Maximální rozsah kapacity pufru (amonný / amoniak) | Kapacita pufru (% vzhledem ke 100% roztoku Aq) |
| 0 | 4.2 – 5.2 | 9.0 – 10.0 | 100 |
| 20 | 4.7 – 5.7 | 8.7 – 9.7 | 80 |
| 40 | 5.0 – 6,0 | 8,5 – 9,5 | 50 |
| 60 | 5,6 – 6,6 | 8,3 – 9,3 | 30 |
Tabulka 1: Doporučené pracovní rozsahy pH a orientační relativní pufrovací kapacity pro eluční systémy 0,1mM octan amonný (aq) / acetonitril
Pomocí pufrovacích rozsahů z tabulky 1 vyberte pH eluentu, ve kterém by měl být analyt 100% ionizován. Všimněte si, že koncentrace pufru použitá k odvození těchto údajů je 0,1 mM – oblíbená volba pro koncentraci pufru při použití MS detekce. Pro zásadité analyty je běžný pufrovací systém kyselina octová/acetát a pH eluentu je obvykle výrazně nižší než pKa zásaditých analytů, což zajišťuje jejich stálou protonizaci. Totéž může platit pro kyselé analyty se systémem amonium/amoniak, kde by měly být všechny kyselé analyty plně deprotonovány. Tím se zajistí stabilní retenční časy, zdravé tvary píků a optimalizace citlivosti MS z hlediska chemie metody.
V účinných rozmezích pufrování pro eluenty na bázi octanu amonného jsou velké mezery. To znamená, že při 20% složení acetrontrilového eluentu (nebo složení výchozího gradientu 20% acetonitrilu) bude pravděpodobně nižší pufrovací kapacita (bude třeba použít vyšší koncentrace pufru) při pH eluentu pod 4,2, mezi pH 5,2 a 9,0 nebo nad 10,0. V případě, že je pH eluentu nižší než 4,2, je třeba použít vyšší koncentrace pufru. Existují i jiné metody, u nichž se pH eluentu upravuje mimo tyto doporučené rozsahy při použití pufrů s octanem amonným. Zvažte použití jiného pufrovacího systému – systém formát/kyselina mravenčí je oblíbenou volbou při hodnotách pH eluentu pod 4,2.
Měl by se vždy použít pufr?
Pokud je pH eluentu daleko od pKa analytu, budou mít malé změny pH eluentu zanedbatelný vliv na stupeň ionizace analytu. Za těchto okolností může být použití pufru zbytečné. Například kyseliny octová (stejně jako mravenčí, trifluoroctová a difluoroctová) mají značnou “samopufrovací” kapacitu při nízkém pH a poskytují základnímu analytu pKa > o 2 jednotky pH vyšší a kyselému analytu pKa
To vše za předpokladu, že se základní analyty analyzují pomocí kyselého elučního systému a kyselé analyty pomocí zásaditějšího pH elučního systému, aby se zajistila plná ionizace a dobrá citlivost elektrosprejové MS. Pokud se vyskytnou problémy se zpětným tlakem přístroje, nestabilitou retenčního času nebo citlivostí detekce MS, pak může stát za zvážení, zda je pufrovací sůl vůbec zapotřebí. Rozumné použití kyseliny mravenčí nebo octové nebo roztoku amoniaku může vyřešit všechny problémy.
Ať už je to jakkoli, věnujte čas pochopení chemie metody s ohledem na pKa vašeho analytu, požadované pH eluentu a volbu pufrovacího systému použitého k dosažení a udržení tohoto pH v systému.
Pro ty, kteří nemají informace o pKa analytu, je k dispozici řada bezplatných programů, které rozumně předpovídají pKa analytu na základě struktury. V našich laboratořích se hojně používají:
- ChemSketch – https://www.acdlabs.com/resources/freeware/chemsketch/
- MarvinSketch – https://chemaxon.com/products/marvin
Pokud hledáte hlubší znalosti o pufrech a jejich použití v rámci HPLC a LC-MS, podívejte se na články v referencích 3-6.
Solubility of Buffers in Aqueous-Organic Eluents for Reversed-Phase Liquid Chromatography, Adam P. Schellinger a Peter W. Carr, LCGC North America Volume 22 Number 6 June 2004
Buffer Considerations for LC and LC-MS, Xavier Subirats, Elisabeth Bosch a Marti Rosés, LCGC North America Volume 27 Number 11 November 2009
Mobile-Phase Buffers, Part I – The Interpretation of pH in Partially Aqueous Mobile Phases, LCGC North America Volume 20 Number 11 November 2002
Mobile-Phase Buffers, Part II – Buffer Selection and Capacity, LCGC North America Volume 20 Number 12 December 2002
Mobile-Phase Buffers, Part III – Buffer Selection and Capacity, LCGC North America Volume 21 Number 1 January 2003
Mobile Phase Buffers in LC: Effect of Buffer Preparation Method on Retention Repeatability, LCGC North America Volume 37, Issue 7, July 2019