3.1 Endogenní enzymy ryb
Jak bylo uvedeno výše, ve vnitřnostech, trávicím traktu a svalové tkáni ryb se nacházejí různé proteolytické enzymy.
Hlavní endogenní proteázy u sardelí byly trypsinu podobná proteináza, pepsin, chymotrypsin, elastáza a aminopeptidáza (Martinez & Serra, 1989; Siringan, Raksakulthai, & Yongsawatdigul, 2006). Trávicí enzymy trypsin, chymotrypsin a pepsin jsou považovány za tři důležitější enzymy ve srovnání s ostatními (de la Parra, Rosas, Lazo, & Viana, 2007). Pepsin se obvykle nachází v žaludku ryb a je hlavním enzymem trávicích šťáv (de la Parra et al., 2007). Trypsin je přítomen ve vnitřnostech, slepém střevě a slezině (Kishimura, Hayashi, Miyashita, & Nonami, 2005, 2006; Kishimura et al., 2007; Klomklao et al., 2006). Hepatopankreas trávicích orgánů ryb a korýšů obsahuje peptidázové i proteinázové aktivity, jako jsou aminopeptidáza, želatinolytické proteázy, trypsin a chymotrypsin a kolagenolytické proteázy (Sriket, 2014).
Zjistilo se, že většina lipolýzových a proteolýzových aktivit při zpracování peda byla zaznamenána ve střevě, zejména na začátku fermentačního procesu; v jeho průběhu však aktivity rychle klesaly (Irianto, 1990). Vzhledem k tomu, že enzymy se nacházejí ve vnitřnostech a trávicím traktu, hraje vykuchání důležitou roli při určování rychlosti a typu probíhajícího enzymatického rozkladu. Fermentované rybí výrobky zpracované z celých ryb budou mít jiné vlastnosti než výrobky vyrobené z ryb bez hlavy a vykuchaných (Wheaton & Lawson, 1985). Enzymatická aktivita většiny viscerálních enzymů a enzymů trávicího traktu z ryb měla největší aktivitu při téměř neutrálních hodnotách pH (Bougatef et al., 2007; Munilla-Moran & Saborido-Rey, 1996).
Castillo-Yañez, Pacheco-Aguilar, Garcia-Carreño a Toro (2004) izolovali z vnitřností sardinek kyselý proteolytický enzym, který patří do třídy asparaginových proteáz. Enzym je podobný pepsinu II z jiných druhů ryb a je stabilní při pH 3-6 a 45 °C.
Céka pyloru představují orgány, které jsou hlavním zdrojem alkalických proteináz. Enzym podobný trypsinu získaný z pylorického caeca tresky obecné (G. morhua) měl izoelektrický bod 5,30 a 5,89 a byl velmi podobný složením aminokyselin hovězímu trypsinu, ale lišil se tím, že měl vyšší relativní množství kyselých aminokyselin a nižší množství bazických aminokyselin. Tento enzym také hydrolyzoval substráty rybích proteinů (Beirão, Mackie, Teixeira, & Damian, 2001).
Tři alkalické proteinázy a dvě kyselé proteinázy byly izolovány ze sardinek. Každá z alkalických proteináz hydrolyzovala kasein rychleji než ostatní bílkoviny. Hlavní alkalická proteináza (III) hydrolyzovala sarkoplazmatické proteiny ze sardinek pětkrát rychleji než ostatní alkalické proteinázy. Každá ze dvou kyselých proteináz hydrolyzovala hemoglobin a myoglobin rychleji než ostatní proteiny. Po předinkubaci s 25 % NaCl byly alkalická proteináza (III) a kyselá proteináza (II) stabilní, zatímco ostatní proteinázy se staly nestabilními. Dvě proteinázy, alkalická proteináza III a kyselá proteináza II, byly stabilní i 3 měsíce po zahájení výroby rybí omáčky. Proteolytická aktivita každé z alkalických a kyselých proteináz byla silně inhibována více než 15 % NaCl; minimální inhibice však byla pozorována, pokud byly jako substrát použity proteiny sardinkové svaloviny (Noda, Van, Kusakabe, & Murakami, 1982).
Dvě aminopeptidasy (I a II) byly extrahovány z odtučněných vnitřních orgánů sardinek a přečištěny pomocí DEAE-celulózové chromatografie, gelové filtrace na Sephadexu G-200 a izoelektrické fokusace. Konečné preparáty enzymů I a II byly polyakrylamidovou gelovou elektroforézou vyhodnoceny jako téměř homogenní. Molekulová hmotnost enzymů I a II byla stanovena gelovou filtrací na 370 000, resp. 320 000 molekul. Izoelektrický bod byl 4,1 (I) a 4,8 (II). Oba enzymy byly inhibovány EDTA a aktivovány Co++. Bestatin mohl inhibovat enzym I, ale ne enzym II. Enzymy I a II rychle hydrolyzovaly nejen syntetické substráty obsahující alanin nebo leucin, ale také di-, tri- a tetra-alanin. Na základě všech těchto vlastností se sardinová aminopeptidáza podobá lidské alaninaminopeptidáze. Enzym I si zachoval více než 70 % své původní aktivity v 15% NaCl, což naznačuje, že se enzym podílí na hydrolyzaci rybích proteinů a peptidů při výrobě rybí omáčky (Vo Van, Kusakabe, & Murakami, 1983).
Aktivita alkalických a kyselých proteináz byla porovnávána s hovězím trypsinem a pepsinem a ukázala, že stejně jako hovězí trypsin alkalická proteináza ze sardinek pyloric caeca hydrolyzuje kasein účinněji než jiné proteinové substráty (Noda et al.,
Enzymy svalové tkáně, zejména katepsiny, peptidázy, transaminázy, amidázy, dekarboxylázy aminokyselin, glutamátdehydrogenázy a příbuzné enzymy, se nacházejí ve svalové tkáni ryb (Chaveesuk, 1991) a tyto enzymy, zejména trypsin, chymotrypsin a katepsin, se podílejí na hydrolýze bílkovin během fermentace rybí omáčky (Fernandes, 2016). Enzymy svalové tkáně se většinou nacházejí v buňkách. Naproti tomu trávicí enzymy jsou exocelulární sekrece. I když některé studie ukázaly, že enzymy svalové tkáně mají optimální aktivitu při neutrálním pH, většina zpráv informuje, že nízké hodnoty pH urychlují aktivitu enzymů svalové tkáně. Většina fermentovaných rybích výrobků se zpracovává při pH vyšším než 4, s výjimkou rybí siláže a některých fermentovaných rybích výrobků. V souladu s tím většina enzymů svalové tkáně ve skutečnosti není v optimálním stavu pH (Mackie et al., 1971).
Částečná charakterizace katepsinů B ze svaloviny kranase obecného naznačila podobné vlastnosti s ostatními katepsiny BS. Optimální pH katepsinu bylo 5 při optimální teplotě 50 °C. Aktivita byla inhibována látkami E-64, CA-074 a chymostatinem (Yoshida et al., 2015).
Maximální aktivity enzymu lze dosáhnout použitím celých ryb včetně hlav a vnitřností. Naopak k minimální aktivitě enzymů dojde, pokud se k výrobě fermentovaných rybích výrobků použijí ryby bez hlav a vykuchané. Mezitím lze dosáhnout střední aktivity enzymů odstraněním vnitřností kdykoli po ulovení ryby, aby se umožnila určitá difúze viscerálních enzymů do tkání (Owens & Mendoza, 1985).
U solených ryb je zrání popsáno třemi hypotézami. Jsou to (1) mikrobiologická teorie, (2) autolytická teorie a (3) teorie enzymů. Podle mikrobiologické teorie mikroorganismy produkují základní aktivní enzymy a tyto enzymy pronikají do masa a přispívají k procesu zrání. Autolytická teorie popisuje, že zrání je výsledkem činnosti enzymů svalů nebo jiných tkání nebo trávicího traktu. A konečně enzymová teorie vysvětluje zrání solených ryb jako probíhající pod vlivem určitých enzymů, a to enzymů obsažených ve svalové tkáni, enzymů v tělních orgánech střeva ryby spolu s enzymy produkovanými mikroorganismy (Mackie et al., 1971).
Při zrání sardelí byla zjištěna maximální autolytická aktivita sardelí indických (Stolephorus indicus) při teplotě 60 °C.
Při zrání sardelí indických (Stolephorus indicus) byla zjištěna maximální autolytická aktivita při teplotě 60 °C. Autolytická aktivita klesala se zvyšující se koncentrací NaCl. Surový extrakt vykazoval optimální pH 8,5-9,5. V surovém extraktu převažovaly proteinázy podobné trypsinu. Proteinázy ze sardelí indických by se mohly podílet na hydrolýze bílkovin během fermentace rybí omáčky. Proto by inkubace sardelí indických při 60 °C a v 10 % NaCl po určitou dobu před úplným nasolením při 25 % NaCl mohla být účinným způsobem urychlení procesu fermentace rybí omáčky (Siringan et al., 2006).
.