AFLATOXINY : Výskyt a zdravotní rizika

Aflatoxiny jsou toxické metabolity produkované některými houbami v/na potravinách a krmivech. Jsou to pravděpodobně nejznámější a nejintenzivněji zkoumanémykotoxiny na světě. Aflatoxiny jsou spojovány s různými onemocněními, jako je aflatoxikóza, u hospodářských zvířat, domácích zvířat a lidí po celém světě. Výskyt aflatoxinů je ovlivněn určitými faktory prostředí, proto se rozsah kontaminace liší v závislosti na zeměpisné poloze, zemědělských a agronomických postupech a náchylnosti komodit k napadení plísněmi během období před sklizní, skladování a/nebo zpracování. Aflatoxinům byla věnována větší pozornost než jiným mykotoxinům, protože byl prokázán jejich potenciální karcinogenní účinek u citlivých laboratorních zvířat a jejich akutní toxikologické účinky na člověka. Jelikož je známo, že absolutní bezpečnosti není nikdy dosaženo, mnoho zemí se pokusilo omezit expozici aflatoxinům zavedením regulačních limitů pro komodity určené k použití jako potraviny a krmiva.

Úvod

V roce 1960 uhynulo v Anglii na drůbežích farmách během několika měsíců více než 100 000 mladých krůt na zjevně nové onemocnění, které bylo označeno jako “nemoc Turkey X” . Brzy se zjistilo, že potíže se neomezují pouze na krůty . Kachňata a mladí bažanti byli rovněž postiženi a došlo k velkému úhynu .

Důkladný průzkum prvních ohnisek ukázal, že všechna souvisela s krmivy, konkrétně s brazilským arašídovým šrotem . Bylo provedeno intenzivní zkoumání podezřelé arašídové moučky a rychle se zjistilo, že tato arašídová moučka je vysoce toxická pro drůbež a kachňata s příznaky typickými pro nemoc Turkey X.

Podle odhadů provedených během roku 1960 ohledně povahy toxinu se zdálo, že by mohl být plísňového původu. Ve skutečnosti byla houba produkující toxin identifikována jako Aspergillus flavus (1961) a toxin dostal podle svého původu název aflatoxin (A.flavis–>Afla).

Tento objev vedl k rostoucímu povědomí o potenciálním nebezpečí těchto látek jako kontaminantů potravin a krmiv způsobujících onemocnění a dokonce i smrt lidí a jiných savců. Studie, které jsou shrnuty v následujících kapitolách, odhalily, že aflatoxiny produkují především některé kmeny A. Flavus a většina, ne-li všechny kmeny A. parasiticus , plus příbuzné druhy A. nomius a A.niger. Kromě toho tyto studie také odhalily, že existují čtyři hlavní aflatoxiny: B1, B2, G1, G2 plus dva další metabolické produkty, M1 a M2, které mají význam jako přímé kontaminanty potravin a krmiv. AflatoxinyM1 a M2 byly poprvé izolovány z mléka kojících zvířat krmených přípravky s aflatoxiny; odtud označení M. Zatímco označení B pro aflatoxiny B1 a B2 je výsledkem modré fluorescence v UV světle, zatímco označení G se vztahuje na žlutozelenou fluorescenci příslušných struktur v UV světle. Tyto toxiny mají velmi podobnou strukturu a tvoří jedinečnou skupinu vysoce okysličených, přirozeně se vyskytujících heterocyklických sloučenin. Jejich molekulové vzorce stanovené na základě elementárníchanalýz a hmotnostních spektrometrických stanovení jsou:

• B1 : C17 H12 O6
• B2 : C17 H14 O6
• G1 : C17 H12 O7
• G2 : C17 H14 O7

Aflatoxiny B2 a G2 byly stanoveny jako dihydroxyderiváty B1a G1. Zatímco aflatoxin M1 je 4-hydroxy aflatoxin B1a aflatoxin M2 je 4-dihydroxy aflatoxin B2.

Výskyt

V zemědělských surovinách :

Aflatoxiny se často vyskytují v plodinách na polipřed sklizní. Ke kontaminaci po sklizni může dojít při opožděném sušení plodin a během skladování plodin, pokud voda překročí kritické hodnoty pro růst plísní. Invaze hmyzu nebo hlodavců usnadňuje napadení některých skladovaných komodit plísněmi.

Aflatoxiny jsou příležitostně zjišťovány v mléce, sýrech, kukuřici, arašídech, bavlníkových semenech,ořeších, mandlích, fících, koření a řadě dalších potravin a krmiv . Mléko,vejce a masné výrobky jsou někdy kontaminovány v důsledku konzumace krmiva kontaminovaného aflatoxiny zvířaty . Komodity s nejvyšším rizikem kontaminace aflatoxiny jsou však kukuřice, arašídy a bavlníková semena.

Ve zpracovaných potravinách :

Kukuřice je pravděpodobně komoditou, která vzbuzuje celosvětově největší obavy, protože se pěstuje v klimatických podmínkách, kde je pravděpodobná trvalá kontaminace aflatoxiny, a kukuřice je základní potravinou mnoha zemí. Postupy používané při zpracování kukuřice však pomáhají snižovat kontaminaci výsledného potravinářského výrobku. Je tomu tak proto, že ačkoli jsou aflatoxiny ve většině potravinářských procesů stabilní až středně stabilní, jsou nestabilní v procesech, jako jsou ty, které se používají při výrobě tortill a které využívají alkalické podmínky nebo oxidační kroky. Aflatoxiny kontaminovaná kukuřice a bavlníková moučka v mléčných krmných dávkách vedly ke kontaminaci mléka a mléčných výrobků aflatoxinem M1, včetně odtučněného sušeného mléka, sýrů a jogurtů.

Faktory podporující produkci aflatoxinů

Růst hub a kontaminace aflatoxiny jsou důsledkem interakcí mezi houbou, hostitelem a prostředím. Vhodná kombinace těchto faktorů určuje napadení a kolonizaci substrátu a typ a množství produkovaného aflatoxinu. Pro růst hub a následnou produkci toxinů je však nutný vhodný substrát, ačkoli přesný faktor (faktory), který (které) iniciuje (iniciují) tvorbu toxinů, není dobře znám. Vodní stres, stres způsobený vysokou teplotou a poškození hostitelské rostliny hmyzem jsou hlavními určujícími faktory pro napadení plísní a produkci toxinů. Podobně byly se zvýšeným růstem plísní a tvorbou toxinů spojeny specifické fáze růstu plodin, nízká úrodnost, vysoká hustota plodin a konkurence plevelů. Tvorba aflatoxinů je rovněž ovlivněna přidruženým růstem jiných plísní nebo mikrobů . Například kontaminaci arašídů a kukuřice aflatoxiny před sklizní podporují vysoké teploty, dlouhodobé sucho a vysoká aktivita hmyzu, zatímco tvorbě aflatoxinů po sklizni kukuřice a arašídů napomáhají vysoké teploty a vysoká vlhkost.

Aflatoxikóza a zdraví zvířat

Aflatoxikóza je především onemocnění jater. Vnímavost jednotlivých zvířat k aflatoxinům se značně lišív závislosti na druhu, věku, pohlaví a výživě. Aflatoxiny totiž způsobujípoškození jater, sníženou produkci mléka a vajec, opakované infekce vdůsledku potlačení imunity (např. salmonelózy), kromě embryotoxicity u zvířat konzumujících nízké koncentrace v potravě. I když jsou mláďata daného druhu nejcitlivější, jsou postiženy všechny věkové kategorie, ale u různých druhů v různém stupni. Klinické příznaky aflatoxikózy u zvířat zahrnují gastrointestinální dysfunkci, sníženou reprodukční schopnost, sníženou využitelnost a účinnost krmiva, anémii a žloutenku. Kojící zvířata mohou být postižena v důsledku přeměny aflatoxinu B1 na metabolitaflatoxin M1 vylučovaný do mléka dojnic.

Indukce rakoviny aflatoxiny byla rozsáhle studována. Bylo prokázáno, že aflatoxinB1, aflatoxin M1 a aflatoxin G1 způsobují různé typy rakoviny u různých druhů zvířat. Pouze aflatoxin B1 je však Mezinárodní agenturou pro výzkum rakoviny (IARC) považován za látku, která poskytla dostatečné důkazy o karcinogenitě u pokusných zvířat, aby mohla být označena za karcinogen.

Aflatoxiny a lidské zdraví

Člověk je aflatoxinům vystaven konzumací potravin kontaminovaných produkty růstu hub. Takové expozici je obtížné zabránit, protože růstu plísní v potravinách není snadné zabránit. Přestože ve vyspělých zemích není povoleno uvádět na trh silně kontaminovanépotraviny,přetrvávají obavy z možných nepříznivých účinků vyplývajících z dlouhodobé expozice nízkému množství aflatoxinů v potravinách.
Důkazy o akutní aflatoxikóze u lidí byly hlášeny z mnoha částí světa, konkrétně ze zemí třetího světa, jako je Tchaj-wan, Ouganda, Indie a mnoho dalších. Syndrom je charakterizován zvracením, bolestmi břicha, plicním edémem, křečemi, kómatem a smrtí s edémem mozku a tukovým postižením jater, ledvin a srdce.

Podmínky zvyšující pravděpodobnost výskytu akutní aflatoxikózy u lidí zahrnujíomezenou dostupnost potravin, podmínky prostředí, které podporují rozvoj plísní v plodinách a komoditách, a nedostatek regulačních systémů pro sledování a kontrolu aflatoxinů.

Protože aflatoxiny, zejména aflatoxin B1, jsou u některých zvířat silnými karcinogeny, je zájem o účinky dlouhodobé expozice nízkým hladinám těchto významných mykotoxinů na člověka . V roce 1988 IARCzařadila aflatoxin B1 na seznam lidských karcinogenů. To podporuje řada epidemiologických studií provedených v Asii a Africe, které prokázaly pozitivní souvislost mezi aflatoxiny v potravě a rakovinou jaterních buněk (LCC) . Kromě toho mohou být projevy onemocnění souvisejících s aflatoxiny u lidí ovlivněny faktory, jako je věk, pohlaví, stav výživy a/nebo současná expozice jiným původcům, jako je virová hepatitida (HBV) nebo napadení parazity.

Nejnovější metody analýzy aflatoxinů v potravinách a krmivech

Odběr a příprava vzorků :

Odběr a příprava vzorků zůstávají značným zdrojem chyb při analytické identifikaci aflatoxinů. Proto je pro stanovení aflatoxinů na úrovni částic na miliardu naprosto nezbytný systematický přístupk odběru vzorků, přípravě vzorků a analýze. V tomto ohledu byly pro některé komodity, jako je kukuřice, arašídy a ořechy, vypracovány a důkladně otestovány zvláštní plány; plány odběru vzorků pro některé další komodity byly vypracovány podle jejich vzoru. Společným rysem všech plánů odběru vzorků je, že celý primární vzorek musí být rozemlet a smíchán tak, aby analytická část testu měla stejnou koncentraci toxinu jako původní vzorek.

Extrakce v pevné fázi :

Všechny analytické postupy zahrnují tři kroky: extrakci, čištění a stanovení. Nejvýznamnějším nedávným zlepšením purifikačního kroku je použití extrakce na pevné fázi.
Testované extrakty se před instrumentální analýzou (tenkovrstvá nebo kapalinová chromatografie) vyčistí, aby se odstranily koextrahované materiály, které často interferují se stanovením cílových analytů.

Chromatografie na tenké vrstvě :

Chromatografie na tenké vrstvě (TLC), známá také jako plošná chromatografie nebo planární chromatografie, je jednou z nejpoužívanějších separačních technik při analýze aflatoxinů. Od roku 1990 je považována za oficiální metodu AOAC a metodu volby pro identifikaci a kvantifikaci aflatoxinů v hladinách až 1 ng/g. Metoda TLC se rovněž používá k ověření nálezů pomocí novějších, rychlejších technik.

Chromatografie kapalin :

Chromatografie kapalin (LC) je v mnoha ohledech podobná TLC, včetně použití analytu, stacionární fáze a mobilní fáze. Kapalinová chromatografiea TLC se vzájemně doplňují. Není neobvyklé, že analytik používá TLC pro předběžnou práci k optimalizaci separačních podmínek LC.
Mezi metody kapalinové chromatografie pro stanovení aflatoxinů v potravinách patří LC s normální fází (NPLC), LC s obrácenou fází (RPLC) s derivatizací před nebo před kolonou (BCD), RPLC s následnou derivatizací po koloně (PCD) a RPLC s elektrochemickou detekcí.

Imunologické metody :

Chromatografie na tenké vrstvě a LC metody stanovení aflatoxinů v potravinách jsou pracné a časově náročné. Často tyto techniky vyžadujíznalost a zkušenosti s chromatografickými technikami pro řešení separačních a interferenčních problémů. Díky pokroku v biotechnologiích jsou nyní komerčně dostupné vysoce specifické testy na bázi protilátek, které mohou identifikovat a měřit aflatoxiny v potravinách za méně než 10 minut. Tyto testy jsou založeny na afinitě monoklonálních nebo polyklonálních protilátek k aflatoxinům. Tři typy imunochemických metod jsou radioimunoanalýza (RIA), enzymová imunosorbční analýza (ELISA) a imunoafinitní kolonová analýza (ICA).

Potvrzení identity aflatoxinů :

Ačkoli analytické metody mohou sestávat z různých kroků extrakce, čištění a kvantifikace, výsledky analýz těmito metodami by měly být při správném použití metod podobné. Jelikož spolehlivost kvantitativních údajů není zpochybněna, problémem, který je třeba ještě vyřešit, je potvrzení identity aflatoxinů. Použité techniky potvrzení zahrnují buď chemickou derivatizaci, nebo hmotnostní spektrometrii (MS).

Problémy bezpečnosti při manipulaci s plesnivými zrny a aflatoxiny :

Bezpečnost je klíčovou otázkou pro vědce pracující v oblasti aflatoxinů. je třeba přijmout opatření k minimalizaci expozice toxinům i produkujícím mikroorganismům Aspergillus flavus a Aspergillusparasiticus. Měl by být zaveden bezpečnostní program, který splňuje požadavky laboratorní normy Occupational Safety andHealth Administration (1990) a směrnice National Institutesof Health (1981) týkající se používání chemických karcinogenů.

Monitorovací techniky pro hodnocení expozice člověka aflatoxinům

V posledních několika letech byly vyvinuty nové technologie, které přesněji monitorují individuální expozici aflatoxinům. Zvláštní pozornost byla věnována analýze aduktů aflatoxinové DNA a aduktů albuminu jako náhradních látek genotoxicity u lidí. Autrup et al.(1983) jako první použili synchronní fluorescenční spektroskopii pro měření aduktů DNA klatoxinů v moči. Ve vzorcích moči odebraných po expozici alfatoxinům bylo zjištěno, že obsahují 2,3-dihydroxy-2-(N7-guanyl)-3-hydroxyaflatoxinB1, triviálně známý jako AFB-Gual . Wild et al.(1986) použili vysoce citlivé imunoanalýzy ke kvantifikaci aflatoxinů v lidských tělních tekutinách. Ke kvantifikaci aflatoxinuB1 v rozmezí 0,01 ng/ml až 10 ng/ml byla použita enzymově vázaná imunosorbční analýza (ELISA), která byla validována ve vzorcích lidské moči. Pomocí této metody bylo zjištěno, že vylučování aduktů aflatoxinu a DNA do moči pozitivně koreluje s příjmem potravy, a ukázalo se, že hlavní adukt aflatoxinu B1 a DNA vylučovaný močí je vhodným měřidlem pro sledování expozice aflatoxinu potravou.

Kontrola a řízení aflatoxinů

A- Regulační kontrola :

Aflatoxiny jsou považovány za nevyhnutelné kontaminanty potravin a krmiv,a to i v případě, že byla dodržena správná výrobní praxe. Úřad FDA stanovil specifické pokyny pro přijatelné hladiny aflatoxinů v potravinách pro lidi a krmivech pro zvířata stanovením akčních hladin, které umožňují odstranění porušujících šarží z obchodu. Akční úroveň pro lidské potraviny je 20 ppb celkového množství aflatoxinů, s výjimkou mléka, pro které je stanovena akční úroveň 0,5 ppb aflatoxinu M1. Akční hladina pro většinu krmiv je rovněž 20 ppb. Je však velmi obtížné přesně odhadnout koncentraci aflatoxinů ve velkém množství materiálu kvůli nestálosti spojené s postupy testování; proto nelze se 100% jistotou určit skutečnou koncentraci aflatoxinů v šarži.

B- Strategie detoxikace :

Protože se kontaminaci aflatoxiny nelze vyhnout, byla navržena řada strategií jejich detoxikace. Patří mezi ně fyzikální metody separace, tepelná inaktivace, ozařování, extrakce rozpouštědlem, adsorpce z roztoku, mikrobiální inaktivace a fermentace. Chemické metody detoxikace jsou rovněž praktikovány jako hlavní strategie účinné detoxikace :

Strukturní degradace po chemickém ošetření :
Různorodá skupina chemických látek byla testována na schopnost degradovat a inaktivovat aflatoxiny. Řada těchto chemických látek může reagovat a účinně ničit(nebo rozkládat) aflatoxiny, ale většina z nich je nepraktická nebo potenciálně nebezpečná z důvodu tvorby toxických reziduí nebo narušení obsahu živin a organoleptických vlastností produktu. Dva chemické přístupy k detoxikaci aflatoxinů, kterým byla věnována značná pozornost, jsou amoniakalizace a reakce s disiřičitanem sodným.
Mnoho studií poskytuje důkazy, že chemické ošetření prostřednictvím amoniakalizace může být účinnou metodou detoxikace kukuřice a dalších komodit kontaminovaných aflatoxiny. Zdá se, že mechanismus tohoto účinku zahrnuje hydrolýzu laktonového kruhu a chemickou přeměnu mateřské sloučeniny aflatoxinu B1 na četné produkty, které vykazují výrazně sníženou toxicitu.
Na druhé straně bylo prokázáno, že disiřičitan sodný reaguje s aflatoxiny (B1, G1 a M1) za různých teplotních, koncentračních a časových podmínek za vzniku produktů rozpustných ve vodě.

Modifikace toxicity chemickými látkami v potravě :
Toxicita mykotoxinů může být silně ovlivněna chemickými látkami v potravě, které mění normální reakce systémů savců na tyto látky.Na účinky aflatoxinů u zvířat může působit různá škála chemických faktorů, včetně nutričních složek(např. bílkovin a tuků v potravě, vitaminů a stopových prvků), potravinových a krmných přísad (např. antibiotik a konzervačních látek), jakož i dalších chemickýchfaktorů.

Změna biologické dostupnosti chemisorbenty aflatoxinů :
Novým přístupem k detoxikaci aflatoxinů je přidávání anorganických sorpčních materiálů, známých jako chemisorbenty, jako je hydratovaný hlinitokřemičitan vápenatý (HSCAS), do krmiva zvířat. HSCAS má schopnost pevně vázat a imobilizovat aflatoxiny v gastrointestinálním traktu zvířat, což vede k výraznému snížení biologické dostupnosti aflatoxinů.

Ekonomický dopad aflatoxinů

Hospodářský dopad aflatoxinů odvozený přímo ze ztrát na úrodě a hospodářských zvířatech a také nepřímo z nákladů na regulační programy určené ke snížení rizik pro zdraví zvířat a lidí. Organizace pro výživu a zemědělství (FAO) odhaduje, že 25 % světových potravinářských plodin je zasaženo mykotoxiny, z nichž nejznámější jsou aflatoxiny. Ztráty způsobené aflatoxiny producentům hospodářských zvířat a drůbeže v důsledku krmiv kontaminovaných aflatoxiny zahrnují úhyn a jemnější účinky potlačení imunitního systému, snížení rychlosti růstu a snížení efektivity krmiva. Mezi další nepříznivé ekonomické účinky aflatoxinů patří nízké výnosy potravinářských a vlákninových plodin .

Schopnost aflatoxinů způsobovat rakovinu a související onemocnění u lidí navíc vzhledem k jejich zdánlivě nevyhnutelnému výskytu v potravinách a krmivech činí z prevence a detoxikace těchto mykotoxinů jednu z nejnáročnějších toxikologických otázek současnosti.

Anon. 1989. Mykotoxiny , ekonomická a zdravotní rizika. Council forAgricultural science and Technology, zpráva č. 116 s. 91.

Eaton, D.L. a Groopman, J.D. 1994. The Toxicology of Aflatoxins [Toxikologie aflatoxinů]. AcademicPress, New York. s. 383-426.

Finley, J.W.,Robinson, S.F. a Armstrong, D.J. 1992. Food Safety Assessment.American Chemical Society, Washington, D.C. pp261-275.

Goldbatt, L.A. 1969. Aflatoxin. Academic Press,New York. pp1-40.

Heathcote, J.G. and Hibbert, J.R. 1978. Aflatoxiny : chemický a biologický aspekt. Elsevier, New York. s.173-186.

Liener, I.E. 1969. Toxin constituents of plant foodstuffs [Toxinové složky rostlinných potravin]. AcademicPress , New york. pp392-394.

Wyllie, T.D. a Morchause,L.G. 1978. Mycotoxin Fungi, Mycotoxins,Mycotoxicoses-An Encyclopedic Handbook.Vols.1,2, and 3.Marcel Dekker, Inc. Newyork.