2.25.2.3.2(iv) Společné cíle u různých typů mozkových buněk

Homeostáza vápníku a buněčná signalizace závislá na vápníku jsou nejčastějšími hlavními cíli u všech typů mozkových buněk. Přestože dvojmocné ionty vápníku (Ca2+) a dvojmocné ionty olova (Pb2+) mají odlišné chemické vlastnosti, kdy ionty vápníku upřednostňují vazbu kyslíku a ionty olova vazbu síry, účinky olova na homeostázu vápníku a vápníkem zprostředkovanou buněčnou signalizaci byly přednostně zaměřeny v historii na toxicitu olova (např. osteoporóza při otravě olovem a signální dráhy proteinkinázy C (PKC)) (Goldstein 1993; Pounds et al. 1991). Identifikace olova silně vázaného na GRP78, protein chudý na cystein (Qian et al. 2000), naznačuje, že olovo může cílit i na proteiny bohaté na nesulfhydryl. GRP78 je protein bohatý na kyselinu glutamovou a asparagovou vázající vápník (17,2 % kyseliny glutamové a asparagové oproti průměrným 11,7 %) (Klapper 1977) a nachází se v ER a přispívá k pufrování vápníku v ER, což je hlavní organela pro ukládání vápníku (Macer a Koch 1988). Vazba olova na GRP78 dále poskytuje pádné důkazy podporující hlavní roli olovem narušené homeostázy vápníku a buněčné signalizace závislé na vápníku v neurotoxicitě olova.

Význam vápníku v buněčné signalizaci je dobře znám. Vápník hraje významnou roli v diferenciaci neuronů, jejich růstu, větvení, migraci, strukturální organizaci, tvorbě synapsí a synaptické plasticitě (Braun a Schulman 1995). Význam vápníkové signalizace je dokumentován také v komunikaci mezi astrogliemi a mezi astrogliemi a neurony (Scemes a Giaume 2006). Proteiny a enzymy přímo či nepřímo závislé na vápníku jsou zapojeny do mnoha buněčných signálních drah a homeostáza vápníku se také podílí na apoptóze nervového systému (Alberdi et al. 2005; Polster a Fiskum 2004). Buněčná signalizace závislá na vápníku je regulována změnami intracelulární koncentrace volných vápenatých iontů prostřednictvím vápníkových kanálů (např. napěťově řízených vápníkových kanálů (VGCC)) nebo pump (např. Ca2+-ATPázové pumpy) na plazmatické membráně nebo intracelulárních zásob (např. ER a mitochondrie). Naopak cykly fosforylace/defosforylace vápníkových kanálů (např. kanálů VGCC a NMDA receptorů) regulované kinázami/fosfatázami závislými na vápníku rovněž regulují intracelulární koncentrace vápníku (Lieberman a Mody 1994; Raman et al. 1996). Neurotoxické látky včetně olova tedy mohou ovlivňovat homeostázu vápníku mnoha způsoby, což povede ke změnám v buněčné signalizaci. Toto téma bylo podrobně rozebráno (Audesirk a Tjalkens 2004), a proto bude tento oddíl zaměřen na společné cíle proteinů nebo enzymů závislých na vápníku a další potenciální společné cíle.

PKC je proteinkináza zprostředkovávající vápník, která se podílí na buněčné signalizaci ve všech typech mozkových buněk (Braun a Schulman 1995). Olovo stimuluje diacylglycerolem aktivovanou PKC závislou na vápníku a fosfolipidech, částečně purifikovanou z mozku potkana, a bylo zjištěno, že pikomolární koncentrace olova jsou při aktivaci PKC ekvivalentní mikromolárním koncentracím vápníku (Long et al. 1994; Markovac a Goldstein 1988). Tento regulační enzym tedy může vnímat hladiny olova očekávané od současných nízkých expozic v životním prostředí. Ačkoli se většina olova nalezeného v mozku ukládá v astroglie, je možné, že se k neuronům a dalším typům mozkových buněk může dostat dostatečné množství olova, aby modulovalo aktivitu PKC. Studie na buňkách PC12 ukázaly, že hladiny olova již od 10 nmol l-1 zvyšují aktivitu PKC, zatímco hladiny 10 μmol l-1 nebo vyšší aktivitu PKC snižují. Přítomnost glutamátu v koncentraci 500 μmol l-1 zhoršila buněčnou smrt vyvolanou olovem, kterou bylo možné částečně blokovat 100 nmol l-1 staurosporinu, inhibitoru PKC, nebo 1 μmol l-1 MK-801, antagonisty NMDA (Jadhav et al. 2000). Podobné výsledky byly pozorovány i v dalších studiích, které ukázaly, že olovo v koncentraci 0,53 μmol l-1 zvýšilo aktivitu PKC o 200 % po 2 h a poté se aktivita vrátila na kontrolní úroveň do 48 h (Tian et al. 2000). Význam aktivity PKC aktivované olovem byl spojen s diferenciací neuronů. Studie na kultivovaných hipokampálních neuronech potkanů uvádějí, že inhibice PKC kalfostinem C zhoršila inhibici iniciace neuritů způsobenou 100 nmol l-1 chloridu olovnatého (Kern a Audesirk 1995), což naznačuje zapojení PKC do neurotoxicity olova. Na rozdíl od této studie olovo v koncentraci 25-100 nmol l-1 stimulovalo NGF indukovaný růst neuritů v buňkách PC12 a bylo zjištěno, že se na stimulaci olovem podílí aktivace proteinkinázy regulované extracelulárním signálem (ERK) (Crumpton et al. 2001; Williams et al. 2000a). Tyto protichůdné výsledky tedy odrážejí složitost, kterou představuje přítomnost více cest iniciace neuritů a více cílů otravy olovem v nervovém systému. Tyrosinhydroxyláza (TH) je vývojovým markerem neuronální diferenciace a její aktivita je regulována PKC. Inhibitor PKC Ro32-0342 potlačil aktivitu TH vyvolanou olovem v buňkách PC12 (Tian et al. 2000). ODC je klíčový regulační enzym polyaminové dráhy, který se podílí na mnoha metabolických procesech ve vyvíjejícím se a zralém nervovém systému. V neokortexu a mozečku mláďat potkanů vystavených laktační expozici olovu prostřednictvím pitné vody matky (0,2% octan olovnatý) od narození do odstavení oslabovala expozice olovu aktivitu ODC i PKC v PND 3 až PND 30. Olovu bylo vystaveno i několik mláďat potkanů. Studie na buňkách PC12 naznačují, že útlum ODC vlivem olova byl způsoben útlumem aktivity PKC vlivem olova, protože aktivita ODC vyvolaná NGF byla oslabena inhibitorem PKC staurosporinem (Hilliard et al. 1999). Aktivita PKC se také podílela na olovem indukované aktivitě transkripčního faktoru Sp1 vázajícího DNA, protože inhibitor PKC staurosporin snižoval olovem indukovanou vazbu Sp1 DNA v buňkách PC12, což bylo podpořeno zjištěním, že aktivita Sp1 vázající DNA byla modulována souběžně s aktivitou PKC v hipokampu potkanů vystavených olovu (Atkins et al. 2003). Předpokládá se, že Sp1 se také podílí na expresi genů NMDA receptorů (Bai a Kusiak 1995). Vazba Sp1 na DNA závislá na PKC by měla hrát důležitou roli v expresi NMDA receptorů modulovaných olovem, i když různé výzkumné skupiny uvádějí rozporuplné výsledky (Cory-Slechta et al. 1997a,b; Guilarte et al. 1993; Lasley et al. 2001; Ma et al. 1997).

Studie odhalily, že aktivace PKC se podílí na olovem vyvolaném zpoždění oligodendrogliogeneze. Olovem indukované snížení proliferace a diferenciace v kultivovaných OP potkanů bylo zrušeno inhibicí PKC bisindolylmaleimidem I, zatímco účinek PKC aktivující látky porbol-12,13-didekanoátu byl olovem potencován. Olovo také způsobilo translokaci PKC z cytoplazmy do membránového prostoru bez zvýšení celkové buněčné aktivity PKC (Deng a Poretz 2002). Sp1 může regulovat genovou expresi MBP a PLP, dvou hlavních strukturních složek myelinu centrální nervové soustavy (Henson et al. 1992; Tretiakova et al. 1999). Lze tedy důvodně předpokládat, že na PKC závislá Sp1 DNA vazebná aktivita se podílí na olovem vyvolaných změnách vývojových profilů PLP a MBP (Zawia a Harry 1995).

Ačkoli žádné přímé důkazy neprokázaly, že by se na PKC závislá Sp1 DNA vazebná aktivita podílela na genové expresi HSP70, HSP90 a GRP78 regulované olovem v astroglie (Opanashuk a Finkelstein 1995; Qian et al. 2000, 2001; Selvin-Testa et al. 1997), zapojení Sp1 a PKC do exprese genů HSP70, HSP90 a GRP78 (Jacquier-Sarlin et al. 1995; Rebbe et al. 1989; Song et al. 2001; Ting a Lee 1988) naznačuje, že olovo by mohlo modulovat expresi těchto genů prostřednictvím regulace vazby DNA Sp1 závislé na PKC. Korelace mezi expresí PKC a GFAP byla profilována v astrogliálních buněčných liniích (Brodie et al. 1998; Masliah et al. 1991). Zbývá však ověřit, zda byla olovem indukovaná nadměrná exprese GFAP zprostředkována prostřednictvím PKC (Harry et al. 1996; Selvin-Testa et al. 1994; Stoltenburg-Didinger et al. 1996; Waterman et al. 1994). Studie na lidech pracujících s olovem podpořily význam olovem modulované aktivity PKC v neurotoxicitě olova, protože olovo v holenní kosti a délka expozice byly významně spojeny s aktivací PKC v erytrocytech (Hwang et al. 2001). Souhrnně lze říci, že PKC pravděpodobně zprostředkovává mnoho aspektů neurotoxicity vyvolané olovem v nervovém systému.

Dehydratáza kyseliny δ-aminolevulinové (ALAD) je klíčový enzym, který katalyzuje přeměnu kyseliny δ-aminolevulinové (δ-ALA) na porfobilinogen v biosyntetické dráze hemu. ALAD je dobře známým molekulárním cílem expozice olovu a její aktivita je inhibována o 50 %, když hladina olova v krvi překročí 20 μg dl-1. Inhibice ALAD vyvolaná olovem vede ke zvýšení cirkulující hladiny ALA. Aktivita ALAD v krvi a hladina δ-ALA v moči se proto používají k diagnostice otravy olovem u dospělých s hladinou olova v krvi vyšší než 35 μg dl-1 a u dětí s hladinou 25-75 μg dl-1. Zvýšená cirkulující hladina ALA navíc snižuje uvolňování GABA v centrálním nervovém systému, což způsobuje neurotoxicitu olova (Patrick 2006b). Ačkoli inhibice ALAD expozicí olovu je identifikována v erytrocytech, ALAD je exprimována ve všech tkáních včetně mozkových tkání a hem je nezbytný pro biosyntézu cytochromů potřebných pro produkci ATP v mitochondriích. Kromě toho má motiv CysCysHisCys vázající zinek v ALAD mnohem vyšší afinitu k olovu s molární absorpční aktivitou 16 000 mol-1 cm-1, což je podstatně více než nejběžnější motiv zinkového prstu, CysCysHisHis, s molární absorpční aktivitou 700 mol-1 cm-1 u jiných proteinů nebo enzymů (Godwin 2001). Proto lze očekávat, že olovo inhibuje aktivitu ALAD v mozkových tkáních, což vede k neurotoxicitě v centrálním nervovém systému.

.