v 60. letech 20. století bylo dosaženo dvou milníků ve fyziologii střevní absorpce cukrů. Prvním byla hypotéza Na+-glukózového kotransportu Cranea a jeho kolegů (1), která vysvětlovala aktivní transport cukru, a druhým byl objev malabsorpce glukózy a galaktózy (GGM) u pacientů (5, 6). Kotransportní hypotéza byla vyčerpávajícím způsobem testována, potvrzena a rozšířena o “aktivní transport” nejrůznějších substrátů do buněk, od akumulace laktózy v Escherichia coli po akumulaci jodidu ve štítné žláze. Kotransportéry jsou v podstatě molekulární stroje, které využívají energii uloženou ve formě gradientů elektrochemického potenciálu iontů přes buněčné membrány, Na+ nebo H+, k pohonu akumulace specifických rozpuštěných látek a vody v buňkách (22). Střevní Na+-glukózový kotransportér (SGLT1) využívá Na+ a elektrické gradienty přes membránu k pohonu cukru a vody do enterocytů proti jejich koncentračnímu gradientu (9, 13, 23). Glukózu i galaktózu přenáší SGLT1, zatímco fruktóza je přes kartáčovou hranici transportována vlastním přenašečem, facilitovaným fruktózovým transportérem (GLUT5). Glukóza, galaktóza a fruktóza dokončí svou cestu přes buňku do krve prostřednictvím dalšího facilitovaného transportéru cukru (GLUT2) v bazolaterální membráně (obr. 1).

GGM je charakterizována novorozeneckým nástupem vodnatého a kyselého těžkého průjmu, který je smrtelný během několika týdnů, pokud není ze stravy odstraněna laktóza (glukóza a galaktóza) (2). Průjem ustane při hladovění nebo vyřazení inkriminovaných cukrů ze stravy, ale okamžitě se obnoví při perorálním podávání stravy obsahující laktózu, glukózu nebo galaktózu. Absorpce fruktózy není ovlivněna. Vzhledem k příznakům onemocnění a tehdejším poznatkům o střevní absorpci cukrů se předpokládalo, že GGM je způsobena defektem Na+-glukózového kotransportéru na hranici kartáčku. Tuto hypotézu posílily vynikající autoradiografické experimenty s vychytáváním galaktózy a vazbou chlorizinu provedené na slizničních biopsiích prvního amerického pacienta s GGM (17, 18). Tyto experimenty ukázaly, že snížení transportu galaktózy bylo spojeno s 90% poklesem vazby chlorizinu na kartáčovou hranici. Florizin je specifický, netransportní, kompetitivní inhibitor SGLT1.

Nejspolehlivějším diagnostickým testem GGM je H2 dechový test (obr. 2). Perorální podání glukózy nebo galaktózy (2 g/kg) vede u pacientů s GGM ke zvýšení H2 v dechu výrazně nad 20 částic/milion, ale u kontrol nebo pacientů krmených fruktózou k takovému zvýšení nedochází. Děti s GGM prospívají “normálně” při náhradní výživě fruktózou, ale příznaky se vracejí i v dospělosti při podávání pouhé čajové lžičky glukózy (6 g) a dechový test H2 zůstává pozitivní. Onemocnění je poměrně vzácné. Celosvětově je nám známo asi 200 pacientů a vysoký podíl případů pochází z příbuzenského vztahu.

Fyziologie a patofyziologie střevní absorpce cukrů pokročila v roce 1987 díky našemu klonování králičího Na+-glukózového kotransportéru pomocí nové strategie, kterou jsme nazvali “expresní klonování”. Tento úspěch byl rychle následován klonováním lidského Na+-glukózového kotransportéru Turkem a Hedigerem (4) a identifikací první mutace v transportéru, která způsobuje genetické onemocnění, GGM, Turkem a spol. Získali jsme střevní biopsie od dvou sester s diagnózou GGM a krevní vzorky od rodičů, kteří jsou bratranci a sestřenicemi. Turk et al. (20) identifikovali homozygotní missense mutaci (Asp28Asn) v cDNA SGLT1 od každé ze sester, zjistili, že každý z rodičů je nositelem této mutace, a prokázali, že mutace skutečně zcela ruší kotransport Na+-glukózy pomocí testu exprese v oocytech. U téhož příbuzenstva byl následně proveden prenatální screening dvou plodů a u jednoho (sourozence probanda) bylo zjištěno, že je nositelem mutace Asp28Asn, a u druhého (bratrance) bylo zjištěno, že je normální. Obě děti prospívaly bez dietních omezení a zůstaly asymptomatické po dobu nejméně dvou let (11).

Dalšímu pokroku zpočátku bránily potíže se získáváním vzorků slizniční biopsie od dětí s GGM, dokud se Turkovi a spol. (21) nepodařilo zmapovat celý lidský gen SGLT1. Tento gen je rozsáhlý, s 15 exony rozmístěnými na 72 kb DNA. Jakmile byly exony a jejich doprovodné oblasti sekvenovány, byl vyvinut test jednovláknového konformačního polymorfismu pro screening pacientů na mutace pomocí genomové DNA z malého vzorku krve. Tento vývoj zahrnoval PCR amplifikaci každého z 15 exonů a jejich intron-exonových spojů a gelovou elektroforézu denaturovaných produktů PCR k identifikaci exonů nesoucích mutace. Anomální exony byly následně sekvenovány. Aby se zjistilo, zda jsou mutace zodpovědné za defekt v transportu cukrů, byly mutanty v oocytech Xenopus laevis exprimovány pro testy vychytávání Na+-glukózy. Za tuto fázi projektu byl z velké části zodpovědný Martı́n (Refs. 10, 12 a nepublikovaná pozorování). Mutace, které jsou příčinou onemocnění, byly identifikovány u 33 z 34 zkoumaných pacientů s GGM. Pacienti v 17 druzích nesli homozygotní mutace a v dalších 10 druzích měli pacienti složené heterozygotní mutace. Jednalo se o 22 missense mutací (viz obr. 3) a 4 splice-site a 3 nonsense mutace, které vedou k tvorbě silně zkráceného proteinu SGLT1. K nezjištění mutací u 34. pacienta mohlo dojít proto, že mutace se nacházela v promotorové oblasti genu a DNA z této oblasti nebyla zahrnuta do screeningového postupu.

Jako transportní fyziolog jsem se zajímal o missense mutace GGM kvůli jejich potenciálu při identifikaci zbytků v proteinu kritických pro transport. Proto jsme se rozhodli zjistit, jak missense mutace skutečně způsobují defekt v transportu Na+-cukru. V rámci tohoto přístupu, který z velké části provedl Lostao (viz citace 10 a 12), byly mutantní proteiny v X. laevisoocytech exprimovány a poté byla pomocí biofyzikálních a biochemických metod stanovena hladina proteinu v buňce a v plazmatické membráně. V případech, kdy byl transportér vložen do plazmatické membrány, jsme (7) zkoumali dílčí reakce transportního cyklu. Zpočátku jsme byli zklamáni, když jsme zjistili, že u prvních 21 studovaných missense mutantů byl primární defekt způsoben chybným uložením transportérů v buňce. Na základě Western blotů se ukázalo, že všechny mutanty byly syntetizovány v podobném nebo vyšším množství než divoký typ SGLT. Měření náboje (7) a zmrazovací elektronová mikroskopie (24) plazmatické membrány oocytu však prokázaly, že došlo k výraznému snížení počtu kotransportérů v plazmatické membráně (10, 12). Podle stupně jádrové a komplexní glykosylace mutantů se defekt v transportu SGLT1 do plazmatické membrány vyskytoval buď mezi endoplazmatickým retikulem a Golgiho, nebo Golgiho a plazmatickou membránou. Chybné skládání mutantních proteinů může být hlavní příčinou chybného transportu (19). Pouze v jednom případě, Gln457Arg, byl mutantní protein v plazmatické membráně oocytu v blízkosti normální hladiny.

Jaký význam mají tyto experimenty na oocytech pro střeva pacientů s GGM? Abychom na to odpověděli, zkoumali jsme (nepublikované údaje) distribuci proteinu SGLT1 pomocí imunocytochemie ve slizničních biopsiích tří pacientů s homozygotní mutací. U všech tří byla distribuce mutantních proteinů v oocytech shodná s distribucí SGLT1 v enterocytech pacienta: u dvou se protein nacházel v cytoplazmě a u jednoho v kartáčové hranici. Existuje také shoda mezi našimi výsledky na oocytech a výsledky získanými autoradiografickými studiemi biopsií od prvního amerického pacienta s GGM (18). Stirling a jeho spolupracovníci (18) zjistili, že vazba chlorizinu na kartáčovou hranici pacientky byla snížena o 90 %, a my jsme v plazmatické membráně oocytů nenašli žádný mutantní protein SGLT1 (Cys355Ser a Leu147Arg) (10). Tyto studie naznačují, že přinejmenším u těchto čtyř mutant GGM oocyt rekapituluje chování mutantního proteinu v enterocytu.

Hlavní zbývající otázkou je, jak missense mutace rozmístěné v celém proteinu (obr. 3) narušují přenos transportéru do plazmatické membrány. Odpovědi na tuto otázku jsou důležité pro pochopení biosyntézy proteinů plazmatické membrány a pro navržení lepší terapie pro děti s GGM.

Mutace GGM u jednoho rodu, Gln457Arg, poskytla neocenitelný vhled do mechanismu transportu cukrů. Lostao studoval (v přípravě) chování Q457R SGLT1 exprimovaného v oocytech a střevní sliznici pacienta a zjistil, že protein je přeložen, glykosylován a vložen do plazmatické membrány, ale není schopen transportovat cukr. V nepřítomnosti cukru přenáší mutantní protein Na+ cestou Na+ leak nebo Na+ uniport a tento transport je blokován chlorizinem. Glukóza je rovněž inhibitorem, protože rovněž blokuje tuto dráhu transportu Na+, což naznačuje, že glukóza se váže na Q457R SGLT1, ale není transportována, tj. mutace způsobuje defekt translokace cukru. Panayotova-Heiermannová a její kolegové (15) nezávisle prokázali, že “pór” pro cukr přes SGLT1 je tvořen COOH-koncovou doménou SGLT1 nesoucí zbytek Q457.

Pro využití těchto pozorování jsme zkoumali roli Q457 v translokaci cukru. V této studii bylo zjištěno, že cysteinový mutant Q457C si zachovává plnou transportní aktivitu Na+-glukózy, kromě zvýšení zdánlivé Michaelis-Mentenovy konstanty glukózy (Km) z 0,4 na 6 mM, a chemickou mutagenezí Q457C s nabitými nebo neutrálními alkylačními činidly (methanethiosulfonáty, MTS) bylo zjištěno, že plně blokuje transport cukru. Protože však alkylovaný protein Q457C váže glukózu s disociační konstantou velmi podobnou zdánlivé Km pro transport cukru proteinem Q457C SGLT1, nesmí být tento zbytek součástí vazebného místa pro cukr. K inhibici transportu cukrů pomocí Q457C pomocí MTS docházelo pouze tehdy, když byl kotransportér v konformaci C2 směřující ven Na+ (obr. 4). Činidlo nebylo účinné v nepřítomnosti Na+, v přítomnosti Na+ a glukózy (nebo chlorizinu) ani v přítomnosti Na+ při depolarizovaných membránových potenciálech. Experimenty s napěťovými skoky s rhodaminem značeným Q457C také ukázaly, že časový průběh a úroveň fluorescence přesně sledovaly přechod kotransportéru mezi konformacemi C2 a C6 (obr. 4). Tyto výsledky interpretujeme tak, že kotransportér může existovat nejméně ve třech různých konformacích (C6, C2 a C3) a že ke spojení mezi transportem Na+ a cukrů dochází prostřednictvím konformačních změn proteinu vyvolaných ligandem a napětím.

Předběžné studie s dalšími dvěma missense mutacemi GGM v COOH-terminální doméně SGLT1, A468V a R499H (obr. 3), ukazují, že nahrazení těchto zbytků cysteiny obnovuje přenos proteinu do plazmatické membrány oocytů. Oba proteiny jsou funkční a transport cukrů je blokován MTS činidly. Stejně jako v případě Q457C jsou tato rezidua přístupná MTS činidlům pouze tehdy, když jsou proteiny v konformaci C2. Tyto výsledky podporují můj názor, že transmembránové šroubovice 10-13 (obr. 3) tvoří cukerný pór. K identifikaci Na+ póru je zapotřebí další práce.

Shrnem lze říci, že molekulárně biologické studie SGLT1 vedly ke klonování cDNA pro lidský SGLT1 a zmapování genu, což poskytlo nové mocné nástroje ke zkoumání fyziologie kotransportu Na+-glukózy a ke studiu GGM. Bylo potvrzeno, že GGM je způsobena mutacemi v genu SGLT1, přičemž většina těchto mutací vede buď ke zkrácení proteinu SGLT1, nebo k chybnému přesunu transportéru v buňce. Jak se předpokládá u autozomálně recesivního onemocnění, soukromá mutace způsobuje onemocnění v každém příbuzenstvu a frekvence onemocnění se zvyšuje v kulturách s vysokou frekvencí příbuzenských sňatků. Ačkoli je GGM vzácná, je možné, že větší skupina jedinců nesoucích mírné mutace SGLT1 nebo závažné mutace na jedné alele má poruchu vstřebávání glukózy a galaktózy. Asi 10 % běžné populace, studentů medicíny, poskytlo pozitivní dechové testy na glukózu H2 (14). Toto rozhraní mezi fyziologií a nemocí nejen zvýšilo porozumění patofyziologii vstřebávání cukrů, ale poskytlo nové přístupy ke studiu molekulárních mechanismů spojení mezi transportem Na+ a cukrů přes plazmatické membrány.

FOTOGRAFIE

• * První ze série vyzvaných článků o genetických poruchách membránového transportu.

.