ImunohistochemieUpravit

Imunohistochemie neboli IHC barvení tkáňových řezů (nebo imunocytochemie, což je barvení buněk) je asi nejčastěji používanou technikou imunobarvení. Zatímco v prvních případech barvení IHC se používala fluorescenční barviva (viz imunofluorescence), nyní se používají jiné nefluorescenční metody využívající enzymy, jako je peroxidáza (viz barvení imunoperoxidázou) a alkalická fosfatáza. Tyto enzymy jsou schopny katalyzovat reakce, při nichž vzniká barevný produkt, který je snadno zjistitelný světelnou mikroskopií. Alternativně lze jako značky použít radioaktivní prvky a imunoreakci lze vizualizovat pomocí autoradiografie.

Příprava nebo fixace tkáně je nezbytná pro zachování morfologie buněk a architektury tkáně. Nevhodná nebo dlouhodobá fixace může výrazně snížit vazebnou schopnost protilátek. Mnoho antigenů lze úspěšně prokázat v parafinových řezech tkáně fixovaných formalínem. Některé antigeny však nepřežijí ani mírnou aldehydovou fixaci. Za těchto podmínek by měly být tkáně rychle čerstvě zmraženy v tekutém dusíku a nařezány kryostatem. Mezi nevýhody zmrazených řezů patří špatná morfologie, špatné rozlišení při větším zvětšení, obtížné řezání přes parafinové řezy a nutnost skladování ve zmrazeném stavu. Alternativou jsou řezy s vibratomem, které nevyžadují zpracování tkáně pomocí organických rozpouštědel nebo vysokých teplot, které mohou zničit antigenicitu, nebo narušení rozmrazováním. Nevýhodou vibratomových řezů je, že proces řezání je pomalý a obtížný u měkkých a špatně fixovaných tkání a že v řezech jsou často patrné stopy po chatu nebo vibratomové linie.

Detekci mnoha antigenů lze výrazně zlepšit metodami získávání antigenů, které působí tak, že rozbíjejí některé příčné vazby proteinů vzniklé fixací a odhalují skrytá antigenní místa. Toho lze dosáhnout zahříváním po různě dlouhou dobu (heat induced epitope retrieval neboli HIER) nebo pomocí enzymového štěpení (proteolytic induced epitope retrieval neboli PIER).

Jedním z hlavních problémů při barvení IHC je překonání specifického nebo nespecifického pozadí. Pro získání kvalitního imunobarvení je důležitá optimalizace fixačních metod a časů, předběžné ošetření blokovacími činidly, inkubace protilátek s vysokým obsahem soli a optimalizace promývacích pufrů a časů po promývání protilátek. Kromě toho je pro stanovení specifičnosti nezbytná přítomnost pozitivních a negativních kontrol pro barvení.

Průtoková cytometrieUpravit

Průtokový cytometr lze použít k přímé analýze buněk exprimujících jeden nebo více specifických proteinů. Buňky se imunobarví v roztoku metodami podobnými těm, které se používají pro imunofluorescenci, a poté se analyzují průtokovou cytometrií.

Průtoková cytometrie má oproti IHC několik výhod, mezi něž patří: možnost definovat odlišné buněčné populace podle jejich velikosti a zrnitosti; schopnost vyřadit mrtvé buňky; lepší citlivost; a vícebarevná analýza pro měření několika antigenů současně. Průtoková cytometrie však může být méně účinná při detekci extrémně vzácných buněčných populací a při absenci tkáňového řezu dochází ke ztrátě architektonických vztahů. Průtoková cytometrie má také vysoké investiční náklady spojené s nákupem průtokového cytometru.

Western blottingUpravit

Western blotting umožňuje detekci specifických proteinů z extraktů vyrobených z buněk nebo tkání, a to před nebo po jakýchkoli purifikačních krocích. Proteiny jsou obvykle separovány podle velikosti pomocí gelové elektroforézy a poté jsou přeneseny na syntetickou membránu metodami suchého, polosuchého nebo mokrého blotování. Membránu lze poté zkoumat pomocí protilátek metodami podobnými imunohistochemii, ale bez nutnosti fixace. Detekce se obvykle provádí pomocí protilátek spojených s peroxidázou, které katalyzují chemiluminiscenční reakci.

Western blotting je rutinní metoda molekulární biologie, kterou lze použít k semikvantitativnímu porovnání hladin proteinů mezi extrakty. Separace velikosti před blotováním umožňuje změřit molekulovou hmotnost proteinu v porovnání se známými markery molekulové hmotnosti.

Enzymová imunosorbční analýzaEdit

Enzymatická imunosorbční analýza neboli ELISA je diagnostická metoda pro kvantitativní nebo semikvantitativní stanovení koncentrace bílkovin z krevní plazmy, séra nebo buněčných/tkáňových extraktů ve formátu desky s více jamkami (obvykle 96 jamek na desku). Obecně se bílkoviny v roztoku adsorbují na destičky ELISA. Na destičku se nanesou protilátky specifické pro bílkovinu, která je předmětem zájmu. Pozadí se minimalizuje optimalizací metod blokování a promývání (stejně jako u IHC) a specifičnost je zajištěna přítomností pozitivních a negativních kontrol. Detekční metody jsou obvykle založeny na kolorimetrii nebo chemiluminiscenci.

Imunoelektronová mikroskopieEdit

Elektronovou mikroskopii neboli EM lze použít ke studiu detailní mikroarchitektury tkání nebo buněk. ImunoEM umožňuje detekci specifických proteinů v ultratenkých řezech tkání. Protilátky značené částicemi těžkých kovů (např. zlata) lze přímo vizualizovat pomocí transmisní elektronové mikroskopie. I když je imuno-EM účinná při zjišťování subcelulární lokalizace proteinu, může být technicky náročná, nákladná a vyžaduje přísnou optimalizaci metod fixace a zpracování tkáně. Biotinylace proteinů in vivo byla navržena s cílem zmírnit problémy způsobené častou nekompatibilitou barvení protilátek s fixačními protokoly, které lépe zachovávají morfologii buněk.

.