Jednalo se o pouhých osm ingrediencí: dva proteiny, tři pufry, dva typy tukových molekul a trochu chemické energie. To však stačilo k vytvoření flotily poskakujících, pulzujících kapiček – rudimentárních struktur podobných buňkám s některými mechanismy potřebnými k samostatnému dělení.

Pro biofyzičku Petru Schwilleovou představují tančící výtvory v její laboratoři důležitý krok na cestě k vytvoření syntetické buňky zdola nahoru, na čemž pracovala posledních deset let, naposledy v Ústavu Maxe Plancka pro biochemii v německém Martinsriedu.

“Vždy mě fascinovala otázka: “Co odlišuje život od neživé hmoty?”,” říká. Výzvou je podle Schwilleho určit, které složky jsou potřebné k vytvoření živého systému. Ve své dokonalé syntetické buňce by znala každý jednotlivý faktor, který ji dělá živou.

Vědci se snaží vytvořit umělé buňky již více než 20 let – skládají biomolekuly ve správném kontextu, aby se přiblížili různým aspektům života. Ačkoli takových aspektů je mnoho, obecně se dělí do tří kategorií: kompartmentalizace neboli oddělení biomolekul v prostoru; metabolismus, biochemie, která udržuje život; a informační řízení, ukládání a správa buněčných instrukcí.

Rychlost práce se zrychluje, mimo jiné díky nedávným pokrokům v mikrofluidních technologiích, které vědcům umožňují koordinovat pohyby nepatrných buněčných komponent. Výzkumné skupiny již určily způsoby, jak tvarovat buněčné kapky do požadovaných tvarů, jak vytvářet rudimentární verze buněčného metabolismu a jak transplantovat ručně vytvořené genomy do živých buněk. Spojení všech těchto prvků dohromady však zůstává výzvou.

Obor je nicméně prodchnut novým optimismem, pokud jde o hledání. Podle biofyzičky Marileen Dogteromové, která vede BaSyC a laboratoř na Technické univerzitě v Delftu, vytvořili v září 2017 výzkumníci ze 17 nizozemských laboratoří skupinu Building a Synthetic Cell (BaSyC), jejímž cílem je do deseti let zkonstruovat “systém podobný buňce, který roste a dělí se”. Projekt je financován nizozemským grantem Gravitation ve výši 18,8 milionu eur (21,3 milionu USD).

V září vyhlásila americká Národní vědecká nadace (NSF) svůj první program zaměřený na syntetické buňky, který je financován částkou 10 milionů dolarů. A několik evropských badatelů, včetně Schwilleho, navrhlo vybudování syntetické buňky jako jeden ze stěžejních programů Evropské komise pro budoucí a vznikající technologie, které dostávají finanční prostředky ve výši 1 miliardy eur.

Syntetičtí biologové předpovídají, že první plně umělé buňky by mohly zažehnout jiskru života za něco málo přes deset let. “Jsem si docela jistý, že se toho dočkáme,” říká Schwille.

Vše v obalu

Výzkumné skupiny učinily velký pokrok při znovuvytvoření několika aspektů života podobného buňkám, zejména při napodobování membrán, které obklopují buňky a rozdělují vnitřní komponenty. To proto, že uspořádání molekul je klíčem k jejich spolupráci ve správný čas a na správném místě. Přestože můžete například otevřít miliardu bakterií a nalít jejich obsah do zkumavky, biologické procesy by dlouho nepokračovaly. Některé složky je třeba držet odděleně a jiné spojit dohromady.

“Podle mě jde o sociologii molekul,” říká Cees Dekker, biofyzik působící rovněž na Technické univerzitě v Delftu.

Většinou to znamená uspořádání biomolekul na lipidových membránách nebo uvnitř nich. Schwilleová a její tým jsou odborníci na manipulaci s membránami. Zhruba před deseti lety začal tým přidávat proteiny Min, které řídí mechanismus dělení bakteriální buňky, na listy umělé membrány z lipidů. Výzkumníci zjistili, že Miny se na membránách objevují a zase z nich vyskakují a způsobují jejich vlnění a víření1. Když však přidali Mins do 3D koulí z lipidů, struktury praskaly jako mýdlové bubliny, říká Schwille. Její skupina a další pracovníci tento problém překonali pomocí mikrofluidních technik, aby zkonstruovali membránové kontejnery o velikosti buněk neboli liposomy, které snesou vícenásobné vložení proteinů – buď do samotných membrán, nebo do jejich nitra.

Schwilleho postgraduální student Thomas Litschel a jeho spolupracovníci rozpustili proteiny Min ve vodě a uvolnili kapičky této směsi do rychle rotující zkumavky. Odstředivá síla táhne kapky skrz vrstvy hustých lipidů, které je po cestě zapouzdřují. Na druhém konci se objeví liposomy o průměru 10-20 mikrometrů, což je přibližně velikost průměrné rostlinné nebo živočišné buňky. Tyto liposomy, známé jako obří unilamelární vezikuly (GUV), mohou být vytvořeny různými způsoby, ale v Litschelových rukou způsobily proteiny Min, že GUV pulzovaly, tančily kolem a smršťovaly se uprostřed2.

Schwilleho skupina chce využít své znalosti těchto proteinů, které mohou vytvářet membránové vzory a samoorganizovat se. “Těmto molekulám rozumíme opravdu dobře,” říká. “Rádi bychom zjistili, jak daleko se můžeme dostat s relativně jednoduchými prvky, jako jsou miny.” Možná, jak naznačuje Litschelova práce, by tým mohl tyto proteiny využít k formování membrán pro dělení nebo ke shromažďování komponent na jednom konci syntetické buňky. Stejně jako někteří fyzikové mohou používat lepicí pásku a alobal k doladění svých experimentů, Schwille říká, že doufá, že tyto šikovné biologické molekuly jí dají možnost pohrávat si se strukturami podobnými buňkám: “Jsem experimentátor do morku kostí.”

Členové Dekkerova týmu také naplnili liposomy svými oblíbenými proteiny pomocí mikrofluidního čipu (viz “Bublinkové stroje”). Na čipu se dva kanály obsahující molekuly lipidů sbíhají do kanálu naplněného vodou a vyplivují liposomy o velikosti buněk, které mohou obsahovat různé biologické molekuly, a to buď přilepené přes membránu, nebo volně plovoucí uvnitř nádoby3.

Jeho skupina experimentovala se stlačováním, deformací a přetvářením liposomů, aby nabývaly nesférických tvarů, které lépe napodobují buňky. Mikrofluidní zařízení dávají výzkumníkům větší kontrolu nad pohybem, tříděním a manipulací s lipozomy pomocí mikrokanálků, které fungují téměř jako obvody. V letošním roce Dekkerova laboratoř navrhla čip, který dokáže mechanicky rozdělit lipozom na dvě části tak, že jej přitlačí k ostrému hrotu4.

“O to nám samozřejmě nejde – chceme demonstrovat rozdělení zevnitř, ale i tak nám to říká zajímavé informace,” říká Dekker. Příkladem může být síla, kterou je třeba vyvinout k rozdělení buňky, a jaké typy fyzikální manipulace liposomy snesou. Stejně tak si jeho tým pohrál s tvarem živých buněk Escherichia coli – udělal je širší nebo čtvercové tím, že je pěstoval v nano-vyrobených silikonových komorách. Členové týmu tak mohou sledovat, jak tvar buněk ovlivňuje mechanismus dělení, a posoudit, jak fungují proteiny Min v buňkách různých velikostí a tvarů5.

“Hrajeme si s nanofabrikačními technikami a děláme věci, které by normální buněčný biolog nikdy neudělal,” říká. “Ale podivný biofyzik, jako jsem já, to udělat může.”

Přidání energie do systému

Teď, když je možné přidávat komponenty do liposomových bublin, aniž by praskly, mohou skupiny plánovat, jak přimět molekuly ke spolupráci. Téměř vše, co je podobné životu, vyžaduje buněčnou energii, obvykle ve formě ATP. A přestože ji lze přidat zvenčí, aby napájela syntetický systém, mnoho biologů pracujících na přístupech zdola nahoru tvrdí, že skutečná syntetická buňka by měla mít vlastní elektrárnu, něco podobného jako mitochondrie živočišné buňky nebo chloroplast rostliny, které obě vytvářejí ATP.

Skupina Joachima Spatze z Institutu Maxe Plancka pro lékařský výzkum v německém Heidelbergu sestrojila rudimentární mitochondrii, která dokáže vytvářet ATP uvnitř vezikuly.

K tomu jeho tým využil nové mikrofluidní techniky. Nejprve stabilizovali GUV tím, že je umístili do kapiček vody v oleji obklopených viskózním obalem z polymerů. Poté, když tyto kapkami stabilizované GUV proudily mikrokanálem, tým do nich vstřikoval velké proteiny, a to buď uvnitř vezikuly, nebo zabudované do povrchu membrány (viz “Montážní linky”).

Na tyto membrány vložili enzym zvaný ATP syntáza, který funguje jako jakési molekulární vodní kolo a vytváří energii ATP z prekurzorových molekul při průtoku protonů membránou. Přidáním kyseliny, která zvýšila množství protonů vně GUV, tým poháněl produkci ATP uvnitř6.

Spatz vysvětluje, že vědci mohli GUV znovu cyklicky obtočit kolem mikrokanálu pro další injekci proteinu, aby postupně přidávali komponenty. Dalším krokem by například mohlo být přidání komponenty, která automaticky nastaví protonový gradient systému.

“To je důležitý modul, jaký máte v reálném životě,” říká Spatz.

Další synteticko-biologická skupina Maxe Plancka vedená biochemikem Tobiasem Erbem se zabývá dalšími přístupy ke konstrukci buněčných metabolických drah. Zajímá se zejména o dráhy, které umožňují fotosyntetickým mikrobům získávat oxid uhličitý z prostředí a vyrábět cukry a další buněčné stavební kameny.

Erb, vedoucí skupiny v Ústavu Maxe Plancka pro pozemskou mikrobiologii v německém Marburgu, používá k syntéze buněčných metabolických drah přístup založený na blankytu. “Z inženýrského hlediska přemýšlíme o tom, jak navrhnout,” říká, “a pak to v laboratoři postavíme.”

Jeho skupina načrtla návrh systému, který by mohl přeměnit CO2 na malát, klíčový metabolit vznikající při fotosyntéze. Tým předpověděl, že tato cesta bude ještě účinnější než fotosyntéza. Poté Erb a jeho tým vyhledali v databázích enzymy, které by mohly provádět jednotlivé reakce. U některých z nich museli upravit existující enzymy do podoby designových enzymů.

Nakonec našli 17 enzymů z 9 různých organismů, včetně E. coli, archeonu, rostliny Arabidopsis a člověka. Reakce byla, možná nepřekvapivě, neúčinná a pomalá7.

“Dali jsme dohromady tým enzymů, které spolu nehrály dobře,” říká Erb. Po dalším enzymovém inženýrství má však tým k dispozici “verzi 5.4”, která podle Erba funguje o 20 % účinněji než fotosyntéza.

Rozšířením této práce začala Erbova skupina konstruovat hrubou verzi syntetického chloroplastu. Rozmělněním špenátu v mixéru a přidáním jeho fotosyntetického aparátu do svého enzymového systému ve zkumavce mohou biologové řídit produkci ATP a přeměnu CO2 na malát – výhradně tím, že na něj posvítí ultrafialovým světlem.

Ačkoli vše může krátkou dobu fungovat ve zkumavce, říká Erb, “nakonec bychom chtěli, aby to bylo kompartmentalizované, jako chloroplast”. Těší se na spolupráci se syntetickými biology, jako je Kate Adamala, kteří dokáží vytvářet a řídit složité kompartmenty.

Skupina Adamaly na Minnesotské univerzitě v Minneapolis pracuje na způsobech, jak vytvořit programovatelné bioreaktory, a to zavedením jednoduchých genetických obvodů do liposomů a jejich spojením do složitějších bioreaktorů. Říká jim “mýdlové bubliny, které vyrábějí proteiny”.

Její skupina vytváří tyto bioreaktory pomocí systému rotujících trubic podobného tomu Schwilleho, který však produkuje menší lipozomy. Výzkumníci do nich přidávají kruhy DNA zvané plazmidy, které navrhli tak, aby plnily určitou funkci, spolu se všemi stroji potřebnými k výrobě proteinů z DNA.

Její skupina například vytvořila lipozomové bioreaktory, které mohou prostřednictvím membránových pórů vnímat antibiotikum ve svém okolí a v reakci na to mohou generovat bioluminiscenční signál8.

Spojováním jednoduchých bioreaktorů postupně dohromady může tým konstruovat složitější genetické obvody. Systémy se však začínají hroutit, jakmile se rozšíří na deset nebo více komponent. Podle Adamaly je to pro tento obor velká výzva. Ve skutečné buňce jsou proteiny, které by se mohly vzájemně rušit, odděleny různými mechanismy. U mnohem jednodušších syntetických buněk musí biologové najít jiné způsoby, jak tuto kontrolu zavést. Mohlo by to být prostřednictvím vnějšího dozoru, kdy experimentátor rozhodne, které liposomy se smíchají a kdy. Mohlo by to být také dosaženo pomocí chemických značek, které regulují, které liposomy se mohou spojit dohromady, nebo pomocí systému časového uvolňování.

Informační injekce

Dalším klíčem k vytvoření buňky je správné nastavení softwaru. Umožnit syntetické buňce řídit se pokyny vědců a replikovat se bude vyžadovat nějaký způsob ukládání a načítání informací. U živých systémů se to děje pomocí genů – od stovek u některých mikrobů až po desítky tisíc u lidí.

O tom, kolik genů bude syntetická buňka potřebovat k tomu, aby mohla sama fungovat, se vedou zdravé debaty. Schwille a další by rádi udrželi počet genů v rozmezí několika desítek. Jiní, například Adamala, se domnívají, že syntetické buňky potřebují 200-300 genů.

Někteří se rozhodli začít s něčím živým. Syntetický biolog John Glass a jeho kolegové z Institutu J. Craiga Ventera (JCVI) v kalifornské La Jolle vzali jeden z nejmenších známých mikrobiálních genomů na planetě, genom bakterie Mycoplasma mycoides, a systematicky narušovali jeho geny, aby identifikovali ty podstatné. Jakmile tyto informace získali, sestavili v laboratoři chemickou cestou minimální genom.

Tento syntetizovaný genom obsahoval 473 genů – asi polovinu toho, co bylo v původním organismu – a byl transplantován do příbuzného bakteriálního druhu Mycoplasma capricolum9. V roce 2016 tým prokázal, že tento minimální syntetický genom dokáže “nastartovat” volně žijící, i když pomalu rostoucí organismus10. Glass se domnívá, že bude těžké toto číslo ještě více snížit: odebrat jakýkoli gen a buď buňky zabije, nebo zpomalí jejich růst téměř na nulu, říká.

On a jeho kolegové z JCVI sestavují seznam “buněčných úkolů” na základě nejnovější verze svého výtvoru JCVI-syn3.0a, který by mohl sloužit jako plán minimálního seznamu úkolů buňky. U přibližně 100 z těchto genů však nedokážou určit, co dělají, že jsou nezbytné.

V dalším kroku, podpořeném grantem NSF ve výši téměř 1 milionu dolarů, se Glass a Adamala pokusí nainstalovat genom JCVI-syn3.0a do syntetického liposomu obsahujícího stroje potřebné k přeměně DNA na bílkovinu, aby zjistili, zda dokáže přežít. V takovém případě by byl software i hardware buňky od počátku syntetický.

Pokud by mohla růst a dělit se, byl by to obrovský krok. Mnozí však tvrdí, že aby skutečně představovala živý systém, musela by se také vyvíjet a přizpůsobovat svému prostředí. To je cíl s nejnepředvídatelnějšími výsledky a také s největšími problémy, říká Schwille. “Věc, která se stále jen vytváří, není život – i když já bych s tím byl spokojen!” říká. “Aby byla buňka živá, musí vyvíjet nové funkce.”

Glassův tým v JCVI provádí adaptivní laboratorní evoluční experimenty s JCVI-syn3.0a, při nichž vybírá organismy, které rostou rychleji v bujónu bohatém na živiny. Zatím se mu a jeho týmu podařilo po asi 400 děleních získat buňky, které rostou asi o 15 % rychleji než původní organismus. A zaznamenali několik změn v genové sekvenci, které se objevily. Zatím však neexistují žádné důkazy o tom, že by si mikrob vyvinul nové buněčné funkce nebo skokově zvýšil svou zdatnost.

Erb říká, že přijít na to, jak syntetickým buňkám dodat evoluci, je jediný způsob, jak je učinit zajímavými. Právě ta trocha nepořádku v biologických systémech jim umožňuje zlepšovat jejich výkonnost. “Jako inženýři nemůžeme vytvořit dokonalou syntetickou buňku. Musíme vybudovat samoopravný systém, který se bude postupem času zlepšovat,” říká.

Syntetické buňky by mohly vést k poznání, jak by mohl vypadat život na jiných planetách. A syntetické bioreaktory pod plnou kontrolou výzkumníka by mohly nabídnout nová řešení léčby rakoviny, řešení rezistence vůči antibiotikům nebo čištění toxických míst. Vypuštění takového organismu do lidského těla nebo do životního prostředí by bylo riskantní, ale shora upravený organismus s neznámým a nepředvídatelným chováním by mohl být ještě riskantnější.

Dogterom říká, že syntetické živé buňky přinášejí i další filozofické a etické otázky: “Bude to život? Bude to autonomní? Budeme to kontrolovat?” Tyto rozhovory by podle ní měly probíhat mezi vědci a veřejností. Pokud jde o obavy, že syntetické buňky budou řádit, Dogterom se obává méně. “Jsem přesvědčen, že naše první syntetická buňka bude mizerně napodobovat to, co už existuje.” A jako inženýři syntetického života mohou ona a její kolegové snadno začlenit kontrolní prvky nebo vypínač, který učiní buňky neškodnými.

Ona a další syntetičtí biologové budou i nadále pokračovat ve zkoumání hranic života. “Načasování je správné,” říká Dogterom. “Máme genomy, seznam součástek. Minimální buňka potřebuje jen několik stovek genů, aby měla něco, co vypadá tak trochu jako živé. Stovky součástek jsou obrovská výzva, ale nejsou to tisíce – to je velmi vzrušující.”