Dr. Bang se velmi zajímal o oběhové systémy bezobratlých. Věřil, že studium živočichů, u nichž lze pozorovat krevní oběh, povede k lepšímu pochopení fyziologických procesů u obratlovců, jako je člověk.
Na počátku 50. let 20. století, kdy působil v Mořské biologické laboratoři ve Wood’s Hole ve státě Maine, studoval Bang oběhový systém kraba podkováře a jeho reakci na bakteriální infekci.
Bakterie získané ze sladké mořské vody vpravoval do různě velkých krabů podkovářů a studoval jejich reakci. Obvykle se v krvi vytvořila malá sraženina, která uzavřela infikované místo a zabránila vniknutí dalších bakterií.
Jednoho dne si však Bang všiml, že jeden z jeho krabů uhynul na neznámou infekci, která způsobila, že se téměř celý objem krve v krabu srazil do polotuhé hmoty.
To nikdy předtím neviděl!
Od prvního zvířete tedy izoloval a vypěstoval bakterii a vstříkl ji dalším krabům podkovářům. Také u nich došlo k identickému srážení krve a zemřeli.
Dalším zkoumáním zjistil, že tuto reakci vyvolávají pouze “gramnegativní” bakterie.
Note: In 1884, Hans Christian Gram invented a staining procedure for microscopy which came to be called The Gram stain. It stains the bacteria either red (Gram-negative) or violet (Gram-positive) depending on the chemicals they have in their cell walls.
Gramnegativní bakterie způsobují infekce, jako je zápal plic a meningitida. Když Bang bakterie před injekcí tepelně zničil, stále se u něj projevovala stejná reakce srážení krve. To znamenalo, že ke srážení krve podkovářů není zapotřebí živých bakterií.
Svá zjištění publikoval v roce 1956 a svá původní pozorování odložil na téměř 10 let.
Přišel Jack Levin.
V roce 1963, když Bang diskutoval o údajích ze svého projektu kraba podkovovitého, navrhl jeho kolega, že spolupráce s hematologem by mohla pomoci rozluštit záhadu srážlivosti. Kolega doporučil výzkumného pracovníka ze své laboratoře, Dr. Jacka Levina.
Levin používal králíky ke studiu Shwartzmanovy reakce – reakce na endotoxiny, která způsobuje tvorbu sraženiny uvnitř cévy a také mění funkci krevních destiček obratlovců.
Endotoxin je klíčovou složkou buněčné stěny všech gramnegativních bakterií; lze jej těžko odhalit a je odolný vůči lékům.
Bang přesvědčil Levina, aby strávil léto v Mořské biologické laboratoři ve Woods Hole, kde studoval podobnosti mezi amebocyty limulus a lidskými krevními destičkami.
Brzy prokázal, že bezbuněčná plazma z kraba podkovovitého se nesráží, ale když studoval krevní buňky, měl problémy s tím, aby se krev nesrážela.
Měl i další problém. Vzorky, které byly v pořádku, když večer odešel z laboratoře, se po jeho ranním návratu srážely, a žádný z antikoagulantů na trhu na tom nic nezměnil.
Serendipity Leads to an Aha! Moment
Levin byl bezradný a začínal být trochu zoufalý, že na to chce přijít!
Mohly by to způsobit bakterie nebo nějaká jejich složka?
Aby tuto možnost otestoval, připravil nové vzorky ve sterilním skle bez endotoxinů. Kupodivu se krev nesrážela!
Tehdy si uvědomil, že identifikoval mechanismus srážení krve, který je spouštěn přítomností gramnegativního bakteriálního endotoxinu.
Konec se mu podařilo prokázat, že celý mechanismus srážení krve v Limulu je obsažen v amebocytech a je extrémně citlivý na přítomnost endotoxinů.
Amebocyty Limulus polyphemus
“Myslím, že pouze výzkumník, který pracoval s endotoxinem, by kdy uvažoval o možnosti, že endotoxin způsobuje srážení krve Limulus,” říká Levin.
To vedlo Levina k vytvoření a patentování extrémně citlivého testu Limulus Amebocyte Lysate (LAL), který dokázal testovat bakteriální endotoxiny pomocí krve kraba podkovovitého.
Jediný jiný test na endotoxiny se v té době nazýval Rabbit Pyrogen Test. V té době americký Úřad pro kontrolu potravin a léčiv vyžadoval, aby všechny injekční léky před schválením k použití prošly pyrogenním testem.
Králičí pyrogenní test byl však nákladný, neefektivní a často nepřesný proces.
Vzorek se vstříkne skupině králíků. Pokud tito králíci dostali horečku, lék v testu neuspěl. Pokud nedostali horečku do 4-6 hodin, lék prošel.
Farmaceutické společnosti musely chovat tisíce králíků, aby mohly tyto testy provádět.
Test LAL může vrátit výsledek již za 45 minut a dokáže odhalit přítomnost endotoxinů v množství menším než jedna část na bilion.
Levin si uvědomil, že má velmi citlivý a rychlý test! To byla tvrdá konkurence pro králičí test.
Test LAL může vrátit výsledek již za 45 minut a může zjistit přítomnost endotoxinů v množství menším než jedna část na bilion.
Ačkoli byl test LAL poprvé popsán v roce 1965, trvalo téměř 20 let, než byl test oficiálně schválen jako endotoxinový test pro konečné produkty úřadem FDA!”
Proč to trvalo tak dlouho?”
Přiznejme si, že lidé neradi něco mění a společnosti se změnám opravdu brání. Přijetí nového, citlivějšího testu znamenalo, že farmaceutické společnosti budou muset přepracovat a nastavit celou novou výrobní linku.
To je čas a peníze!
Ale smetana nakonec stoupá nahoru; tento test byl a stále je smetanou!
Poptávka po LAL je nyní tak vysoká, že se stal jednou z nejcennějších kapalin na Zemi, přičemž jeho cena se v dubnu 2018 údajně pohybovala mezi 35 000 a 60 000 dolary za galon!
Škálování testu LAL
Test LAL byl Bloombergovou školou veřejného zdraví Johna Hopkinse označen za jeden ze “100 nejvýznamnějších přínosů pro veřejné zdraví”.
Podle Jacka Levina se jedná o standardní screeningový test na kontaminaci endotoxiny na celém světě, přičemž ročně je testováno přibližně 17,5 milionu vzorků (což představuje zhruba 70 milionů provedených testů). Komerčně se používá k testování všech intravenózních tekutin, parenterálních léčiv a implantabilních zdravotnických prostředků před jejich použitím u pacientů.
Jak se LAL vyrábí?
Krabové podkováři jsou odchyceni a je do nich zapíchnuta hadička, kterou se odsává jejich krev (viz obrázek výše). Poté se odebraná krev odstředí, aby se koncentrovaly amebocyty. Přidáním vody k zabaleným amebocytům dojde k jejich rozpadu a uvolnění koagulačních proteinů (lyzátu), které reagují s endotoxiny.
Tento způsob výroby LAL je propagován jako nesmrtící metoda získávání krve krabů. Ale není tomu tak. Ne všichni krabi totiž přežijí!”
Podle údajů Státní komise pro mořský rybolov v Atlantiku (Atlantic State Marine Fisheries Commission), uvedených ve zprávě o referenčním hodnocení a vzájemném hodnocení populace krabů podkovovitých z roku 2019, je pro uspokojení roční poptávky po LAL odchyceno a vykrveno 600 000 krabů podkovovitých.
Z těchto 600 000 krabů jich proceduru přežije přibližně 420-540 000 (70-90 %). Připočtěte k tomu zásahy do biotopů, globální oteplování a dalších více než 500 000 kusů, které jsou každoročně odloveny a zabity pro použití jako návnada při lovu úhořů a pštrosů, a pochopíte, proč populace krabů podkovních prudce klesá.
Nejen to, krabi jsou loveni v květnu a červnu, kdy se houfně vydávají na břeh, aby se pářili, nakladli vajíčka a snad si udrželi přežití.
Tato situace není udržitelná!
Existují lepší způsoby výroby LAL?
“Podkovář americký přežil dinosaury a přežil čtyři předchozí masová vymírání, ale nyní je ohrožen farmaceutickým průmyslem, rybářskými komunitami, ztrátou stanovišť, klimatickými změnami a nejnověji dusivými přívaly červených řas u východního pobřeží Spojených států.” Jonathan Watts v deníku The Guardian
Jsou dvě hlavní snahy, které jsou uváděny jako způsoby, jak tuto neblahou situaci zmírnit.
Jedním z přístupů, který zkouší farmaceutický průmysl, je akvakultura podkovovitých krabů.
Původně nebyly pokusy o chov podkovovitých krabů příliš úspěšné. Zdálo se, že po 3-4 měsících chovu klesla koncentrace bílkovin v hemolymfě na úroveň, která vedla k úhynu. Předpokládalo se, že tato úmrtí souvisejí s nedostatkem živin.
Dr. Anthony Dellinger je profesorem na katedře neurověd na Univerzitě Severní Karolíny v Greensboro a vědeckým pracovníkem společnosti Kepley Biosystems Incorporated, Greensboro, NC.
Dellinger a KBI usilovně pracují na vývoji nového, vylepšeného systému akvakultury. Jejich předpokladem je, že “řízený sběr LAL z monitorovaných a dobře udržovaných krabů podkovovitých v akvakultuře by mohl zvýšit množství dodávek LAL, zajistit životaschopnost druhu a umožnit nové klinické inovace.”
Pokud by se to podařilo, spolehlivá, udržitelná a ekonomická produkce většího množství LAL by byla přínosem pro přírodu i průmysl.
Dellinger a jeho kolegové podrobně popsali fungování svého akvakulturního systému v článku publikovaném v časopise Frontiers of Marine Science letos v dubnu.
Podívejme se na nejdůležitější body a výsledky této studie.
Nejprve optimalizovali vnitřní recirkulační akvakulturní systém, který spolehlivě udržuje podkovovité kraby. Jejich cílem bylo usnadnit opakovaný sběr LAL při zachování dobrých životních podmínek zvířat.
Dalším milníkem bylo dosažení metody opakovaného sběru s nízkým dopadem. Za tímto účelem chirurgicky implantovali do podkovovitých krabů katétr. Všechny jejich testy ukázaly, že krabi podkováři tyto katétry snášejí poměrně dobře.
Tady je stručné shrnutí jejich výsledků:
Odlovili a udržovali 24 krabů po dobu jednoho roku se 100% přežitím. U krabů podkovářů kontrolovali aktivitu LAL, uvolňování vajíček a spermií a další příznaky, které by mohly naznačovat zhoršený zdravotní stav. Žádné takové příznaky nebyly pozorovány.
Krabové krváceli z katétrů přibližně třikrát měsíčně, což potenciálně představuje asi 36 krvácení na jednoho kraba za 12 měsíců. Během tohoto období se nevyskytly žádné problémy způsobené implantovanými katetry.
Když vyčíslili vzniklé náklady mimo počáteční uspořádání systému akvakultury, vyšlo udržování krabů na přibližně 0,76 dolaru za libru, což je velmi přijatelná částka!
Nejdůležitější otázka, kterou bylo třeba zodpovědět, zněla:
Jaká je LAL z podkovovitých krabů udržovaných ve vlastní režii ve srovnání s LAL získanou z čerstvě ulovených krabů?
Jak ukazuje obrázek 6 z jejich práce, nebyl zjištěn žádný významný rozdíl v koagulační aktivitě LAL endotoxinů mezi kraby z akvakultur a volně žijícími kraby. A žádný skutečný rozdíl nebyl ani v aktivitě z krvácení odebraného ve dnech 1, 16 a 23.
Tyto výsledky je vedly k závěru,
“…akvakultura by mohla odpovídat potřebám průmyslu po dobu několika let s ekvivalentem 5-10 % ročního úlovku, přičemž ve volné přírodě by poté každý rok zůstalo téměř 600 000 HSC. Ve skutečnosti tato zjištění naznačují, že ∼60 000 HSC z akvakultury by mohlo být udržitelně vykrmeno 12-24krát ročně a převýšit současnou biomedicínskou poptávku po LAL.”
Druhý přístup zcela eliminuje potřebu krabů.
Jeak Ling Ding spolu se svým manželem a partnerem ve výzkumu Bow Ho v Singapuru měli cíl – zcela eliminovat potřebu krabů podkovářů.
Studovala asijský druh Carcinoscorpius rotundicauda, který byl mnohem menší než atlantičtí krabi podkováři a nemohl být příliš vykrvován, aniž by zemřel.
Dingův výzkum LAL vedl k objevu, že za jeho srážlivost je zodpovědná molekula nazývaná faktor C.
Dingova studie se zaměřila na to, aby zjistila, zda je krab LAL schopen srážet krev. Ding izoloval gen pro faktor C a pomocí viru jej vložil do střevních buněk hmyzu. Tím v podstatě proměnil brouky v malé továrny, které vyráběly faktor C.
Modifikovaný hmyz vyráběl dostatečné množství faktoru C, který se pak mohl prodávat na trhu jako rekombinantní* faktor C (rFC) jako životaschopná náhrada LAL.
* Note: The word recombinant is a term used in molecular genetics to indicate a gene that has been isolated (cloned) and inserted into another organism's DNA so that organism makes the protein that gene specifies. Using a virus is one of many ways to accomplish this.
Nyní by tedy místo sběru nebo akvakultury podkovářů a jejich vykrvování mohli pěstovat velké množství hmyzu a izolovat rFC.
Farmaceutické společnosti, které rFC použily, potvrdily, že funguje stejně dobře jako LAL a výrobní náklady jsou srovnatelné.
“Byli jsme jako výzkumníci tak nadšení, tak šťastní, že to funguje,” řekl Ding. “A mysleli jsme si, že se rekombinantní faktor C prosadí po celém světě a podkovář bude zachráněn.”
Naneštěstí se rFC potýkal se stejnými překážkami při zavádění jako LAL. Přestože je rFC na trhu od roku 2003, prosazuje se pomalu. Postupně však překonává překážky, které bránily jeho schválení úřadem FDA. Původně jej vyráběl pouze jeden výrobce – švýcarská chemická společnost Lonza Group.
V roce 2013 se druhou společností vyrábějící rFC stala společnost Hyglos GmbH. Kevin Williams, vedoucí vědecký pracovník společnosti Hyglos, říká, že přijetí a schválení rFC považuje za dlouho očekávané. Společnost Hyglos GmbH získala souhlas s jeho používáním od několika evropských regulačních orgánů.
Dnes se odborníci domnívají, že se rFC nakonec stane dominantní metodou detekce endotoxinů, čímž se podkováři zcela zbaví háčku průmyslové výroby.
Tak s tím se podkováři smíří!”
Note: In these times of COVID-19, I wouldn't be surprised to see the obstacles removed even faster. Taking and applying research knowledge to improve patient wellbeing is happening faster than ever before. And in cases like this, that's a really good thing!
Což nás přivádí k poslední otázce, kterou se chci zabývat:
Proč nám vlastně záleží na tom, aby podkováři přežili?”
Nejsou to jen prastaré relikty, bez kterých by se náš moderní ekosystém snadno obešel? Spousta jiných druhů už vyhynula a planeta se zdá být docela v pořádku.
To je správná otázka, tak se na ni podívejme trochu hlouběji.
Odpovědí na první pohled je: “Samozřejmě, že je chceme zachránit!”. Na této planetě máme dost tvorů, kteří jsou již ohroženi nebo kteří již vyhynuli. Nemůžeme si prostě dovolit přijít o další.”
Jak jsem řekl, je to spíš reakce instinktu, ne odpověď, na kterou by se dalo pověsit. Pro lepší odpověď se musíme podívat, jak krabi podkováři zapadají do celkového obrazu.
Začněme tím, čím se živí a co je žere.
Dospělý krab podkovář se živí malými měkkýši, jako je modrá škeble a škeble příbojová, a hlísticemi.
Podle této zprávy The Safina Center at Stony Brook University z roku 2017 nejsou modré škeble ve vážném ohrožení. Totéž platí pro annelidy i příbojové mlže.
Mladí jedinci se živí malými částicemi řas i živočišných látek. S rostoucí velikostí živočicha roste i kořist, kterou konzumuje.
Vcelku to vypadá, že krabi podkováři nemají na své druhy kořisti žádný škodlivý vliv.
Ok, to je jedna strana mince. A co ta druhá? Co se kraby podkováři živí?
Vajíčka krabů podkovovitých jsou zdrojem potravy pro mnoho organismů.
Mezi ně patří pobřežní ptáci, některé ryby – okoun pruhovaný, střevlička pruhovaná, stříbřitá, platýs – a také mořské želvy, krabi a mihule. Jsou kritickým zdrojem potravy pro 11 druhů stěhovavých pobřežních ptáků. Ztráta těchto vajíček by tyto ptačí populace zničila.
Na krabech podkovářích jsou závislé mořské želvy a pobřežní ptáci, jako je například červenka.
Tisíce těchto želv v létě migrují do Chesapeake a Delaware Bay, aby se kraby živily. Nyní se předpokládá, že podkováři trpí nedostatkem krabů v Chesapeaku.
Několik anekdot uvádí, že se krabi objevují v břiše aligátorů a žraloků.
Mláďata krabů podkovářů by také mohla být klíčovou potravou v pobřežním potravním řetězci. Během léta a podzimu se na mělčinách hemží larvy a raná stádia podkovářů. Tato sousta nepochybně hltají i ryby a pobřežní ptáci.
A zdá se, že existuje spousta dalších živočichů, kterým docela chutnají a těžko by za ně hledali snadnou náhradu.
Na tvora, který je na světě již 450 milionů let, nejsou naše znalosti o roli, kterou Limulus polyphemus hraje v pobřežním ekosystému, zdaleka úplné.
Při současném stavu našich znalostí ekologie krabů podkovovitých nemůžeme učinit definitivní závěr o tom, jak zásadní je jejich role. Můžeme však říci, že rozhodně zaujímají niku, která si zaslouží serióznější studium.
I tak se stavím na stranu nutnosti jejich ochrany! Je to můj postoj “raději v bezpečí, než abych litoval”. Víme toho prostě příliš málo na to, abychom si nechali druh, jako je Limulus polyphemus, proklouznout mezi prsty a zmizet, pokud tomu můžeme zabránit.
Můžete tedy něco udělat?
Pokud náhodou žijete v blízkosti místa, kam podkováři přilétají klást vajíčka, je snadné se přihlásit a pomoci. Existují programy obracení krabů a průzkumy tření krabů, které spoléhají na dobrovolníky.
A nakonec, až půjdete k lékaři, vzpomeňte si na kraby podkováře. Cokoli, co se nám vstřikuje nebo implantuje do těla, se stále testuje na kontaminaci gramnegativními bakteriemi pomocí LAL vyrobeného z krve krabů podkovních.
Do příště
Rich
Hej! Pokud se vám tento článek líbil, přihlaste se k odběru mého newsletteru a získejte ebook zdarma!
Zdroje informací použité pro tento článek:
- Krab podkovovitý
- Akvakultura kraba podkovovitého jako udržitelný zdroj pro testování endotoxinů
- Úloha krabů podkovovitých v biomedicínském průmyslu a nejnovější trendy ovlivňující udržitelnost druhu
- Poslední dny modrého-Blood Harvest
- The Underwater Secrets of Horseshoe Crabs
- Tento krab by vám mohl zachránit život – pokud ho dřív nevyhubí lidé
- NJ ukončil sběr krabů podkovovitých. Měly by totéž udělat i ostatní státy?
- Stránky o krabech podkovářích vytvořila Kayla Westerlund
- Krab podkovář atlantský
.