Skinocelulární karcinom jícnu (ESCC) a jeho léčba

Nádorové onemocnění je život ohrožující onemocnění, které na celém světě způsobuje přibližně 8 milionů úmrtí ročně. Karcinom jícnu zaujímá šesté místo na seznamu nejčastějších příčin úmrtí souvisejících s rakovinou a každoročně se podílí na přibližně půl milionu úmrtí (GLOBOCAN 2012). Z různých podtypů karcinomu jícnu je ESCC převažujícím histologickým typem a je vysoce rozšířen v méně rozvinutých oblastech, zejména v některých regionech Asie a Afriky. Pacientům s ESCC je nabízena multimodální léčba. Pacienti v časném stadiu s resekabilním nádorem jsou léčeni resekcí nádoru, zatímco pacienti v pokročilém stadiu jsou před chirurgickou resekcí nejprve léčeni chemoterapií/chemoradioterapií za účelem downstagingu nádoru . Ačkoli tato předoperační neoadjuvantní léčba může dosáhnout vynikající odpovědi u podskupin pacientů, kteří jsou citliví na chemoterapii/chemoterapii, přibližně třetina pacientů stále vykazuje pouze částečnou a suboptimální odpověď. I u respondérů na chemoterapii/chemoterapii se u některých z nich může v dalším průběhu léčby vyvinout rezistence. U pacientů, jejichž nádory jsou neresekabilní a kdy je nádor refrakterní na chemoterapii nebo radioterapii, není k dispozici žádná účinná léčba . S cílem poskytnout více možností léčby pacientům, kteří nejsou ovlivnitelní současnou léčbou, jsou navrhovány nové léčebné přístupy, jejichž protinádorová účinnost je hodnocena v probíhajících klinických studiích. I přes všechny tyto vyvíjející se a nově se objevující léčebné modality je úplné vyléčení onemocnění stále obtížné. In view of this, new treatments are urgently needed.

Použití zvířecích modelů nádorových xenograftů pro preklinický výzkum

Hlavním účelem vývoje zvířecích modelů nádorových xenograftů pro výzkum je propojení základního a klinického výzkumu a doplnění použití modelových systémů in vitro . Nádorové xenograftové zvířecí modely poskytují sofistikovanější platformu pro studium procesu nádorového bujení v prostředí in vivo. Tato platforma nám umožňuje lépe porozumět zapojení určitých onkogenů nebo nádorových supresorů do vývoje nádorů odhalením jejich souvisejících signálních drah a mechanismů onemocnění . Kromě toho nám použití těchto modelů může poskytnout výzkumný nástroj pro preklinické hodnocení odezvy na léčiva tím, že kromě toxicity, farmakokinetiky a farmakodynamiky léčiv stanovíme i protinádorovou účinnost . Kromě hodnocení reakce na léčiva mohou tyto modely také usnadnit výzkum biomedicínského zobrazování tím, že poskytují modelový systém pro testování užitečnosti a praktičnosti nových metod detekce nádorů nebo činidel.

Myši jsou nejčastěji používanými zvířaty pro modely nádorových xenotransplantátů kvůli několika klíčovým výhodným vlastnostem, jako je přítomnost srovnatelné velikosti genomu s člověkem, krátký reprodukční cyklus, velká velikost vrhu, nízké náklady na údržbu a snadná manipulace . Ve výzkumu rakoviny se používají různé kmeny myší s jedinečným imunodeficitním pozadím, mezi něž patří athymické nahé myši, SCID myši a NOD/SCID myši (SCID myši s další úrovní imunodeficitu). Z těchto kmenů vykazují nejlepší imunodeficienci myši NOD/SCID díky absenci nebo defektu téměř všech typů imunitních buněk (B-lymfocytů, T-lymfocytů, dendritických buněk, makrofágů a přirozených zabíječů), následují myši SCID s nedostatkem B-lymfocytů a T-lymfocytů a pak athymické nahé myši bez T-lymfocytů. Vzhledem k různým úrovním imunodeficitu se uvažuje o použití různých kmenů pro různé výzkumné účely. S ohledem na náklady a vlastnosti různých kmenů se pro implantaci lidských nádorových buněčných linií přednostně používají athymické nahé myši a SCID myši, zatímco SCID a NOD/SCID myši se používají spíše pro transplantaci lidských nádorů.

Obvykle používané zvířecí modely nádorových xenotransplantátů pro výzkum ESCC

Tři typy zvířecích modelů nádorových xenotransplantátů pro výzkum ESCC se vyvíjejí implantací buněk/xenotransplantátů ESCC nebo nádorů pacientů do imunodeficitních zvířat, a to subkutánní, ortotopický a model nádorového xenotransplantátu odvozeného od pacienta (obr. 1). Každý z nich má své silné a slabé stránky, pokud jde o vlastnosti modelu (tabulka 1), metody založení (tabulka 2) a preklinickou využitelnost (tabulka 3), které je staví do jedinečné pozice pro výzkum v raném, středním nebo pozdním stadiu .

.

Podkožní model nádorového xenotransplantátu

Podkožní model nádorového xenotransplantátu je klasický zvířecí model pro výzkum ESCC. Tento model se vytváří implantací buněk/xenotransplantátů ESCC pod kůži imunodeficitních zvířat za účelem vzniku podkožních nádorů. Postup vytvoření podkožního nádoru je technicky jednoduchý, protože zahrnuje pouze injekci buněk ESCC jehlou nebo přímou implantaci xenotransplantátů ESCC pod kůži zvířat. Růst podkožních nádorů lze provádět neinvazivně pomocí elektronického kalibru k měření hmatných nádorů. Tyto technické postupy založení a sledování nádorů mohou zachovat reprodukovatelnost a efektivitu (časovou i finanční) tohoto modelu. Navzdory těmto výhodám trpí tento model určitými omezeními, protože plně nereprezentuje klinickou situaci. Tento model například asociuje sníženou heterogenitu nádoru, protože ve většině scénářů se jako zdrojový materiál používají homogenní buněčné linie ESCC. Kromě toho subkutánní nádory nerostou v přirozeném nádorovém mikroprostředí, a proto nejsou vhodné pro studium interakcí mezi nádorem a stromatem. Díky těmto silným a slabým stránkám se tento model používá hlavně v raných fázích výzkumu ke studiu biologie a mechanismu nádorového bujení ESCC.

Hromadící se zprávy odhalily milník použití modelu subkutánního nádorového xenograftu pro rané fáze výzkumu tím, že se používá ke studiu nádorových vlastností molekul souvisejících s ESCC a s nimi spojených mechanismů onemocnění. Nadměrná exprese mikroRNA-340, mikroRNA downregulované v nádorech ESCC, v buňkách ESCC EC9706 inhibovala růstové vlastnosti těchto buněk v modelu subkutánního nádorového xenograftu. Účinek této mikroRNA na ESCC byl částečně zprostředkován jejím účinkem na proteinovou transferázu PSAT1, která byla ve stejné studii identifikována jako přímý cíl mikroRNA-340 . Jiná studie prokázala rychlejší růst subkutánních nádorů odvozených z buněk KYSE-30 ESCC s nadměrnou expresí matrixové metaloproteinázy MMP1 ve srovnání s kontrolními buňkami. Kromě toho tyto ESCC buňky s overexpresí MMP1 vykazovaly také metastatický potenciál. Shodně se ukázalo, že schopnost MMP1 podporovat progresi nádoru a metastazování je způsobena jejím stimulačním účinkem na tumorigenní dráhu zahrnující PI3K a AKT . Samostatná zpráva rovněž využila model subkutánního nádorového xenograftu k odhalení buněčného proteinu vázajícího kyselinu retinovou 2 (CRABP2) jako nádorového supresoru tím, že prokázala pomalejší rychlost růstu subkutánních nádorů odvozených z buněk EC109 ESCC nadměrně exprimujících CRABP2 ve srovnání s kontrolní experimentální skupinou . Tyto studie společně naznačují užitečnost tohoto modelu pro studium molekul souvisejících s ESCC a jejich souvisejících mechanismů u ESCC.

Kromě použití subkutánního modelu xenograftu pro studium biologie nádorů byly učiněny pokusy o využití tohoto modelu ke zkoumání protinádorové účinnosti nových léčebných metod nebo sloučenin/léků pro léčbu ESCC. Myši se subkutánním nádorem byly podrobeny léčbě za účelem navození exprese prognostického markeru ESCC mikroRNA-375 a na konci pokusu bylo dosaženo menší velikosti nádoru ve srovnání s kontrolním pokusem . Kromě rutinního použití ke zkoumání nových léčebných metod byl tento model použit také ke zkoumání protinádorové účinnosti nových sloučenin/léků proti ESCC, jako je temsirolimus, který se v současné době používá u pacientů s karcinomem ledvin . Kromě jeho užitečnosti při testování protinádorové účinnosti lze tento model použít ke zkoumání chemosenzibilizačních účinků testovaných sloučenin. Ošetření subkutánních zvířat s nádorem ginsenosidem Rg3, složkou získanou z ženšenu, poskytlo důkazy prokazující senzibilizační účinky této sloučeniny na dvě chemoterapeutika paklitaxel a cisplatinu běžně používaná u pacientů s ESCC . Nedávno bylo prokázáno, že nový nosič kyslíku YQ23 má selektivní chemosenzibilizační účinky na chemorezistentní subkutánní xenografty SLMT-1 ESCC, ale nikoli na chemosenzitivní xenografty HKESC-2 ESCC, v léčebných plánech s použitím cisplatiny nebo 5-fluorouracilu, což jsou rovněž tradiční chemoterapeutika používaná u pacientů s ESCC . Výše uvedené studie zkoumající protinádorovou účinnost testovaných sloučenin/léčiv samostatně nebo v kombinaci s běžnými chemoterapeutiky používanými u ESCC zdůraznily preklinickou užitečnost subkutánního modelu nádorového xenograftu pro testování sloučenin/léčiv.

Shrnem lze říci, že subkutánní nádorové xenografty, zejména ty, které jsou dobře charakterizovány z hlediska citlivosti vůči chemoterapeutikům používaným v současnosti pro ESCC, jsou cennými výzkumnými nástroji pro studium biologie nádoru a mechanismů onemocnění ESCC v prostředí in vivo a pro provádění preklinických studií protinádorové účinnosti (tabulka 3).

Ortotopický model nádorového xenograftu

Ortotopický model nádorového xenograftu je alternativním zvířecím nádorovým modelem používaným pro výzkum ESCC. Tento model se vytváří implantací buněk/xenografů ESCC do jícnu imunodeficitních zvířat za účelem vzniku ortotopických nádorů. Postup založení ortotopických nádorů je technicky náročnější ve srovnání s postupy potřebnými pro založení subkutánních nádorů, protože vyžaduje operaci a/nebo anestezii malých zvířat. K implantaci buněk/xenografů ESCC do jícnu zvířat se používají dva hlavní přístupy, které se liší místem implantace nádoru. Jedna metoda implantuje buňky/xenografty ESCC do horní části jícnu, zatímco druhá metoda implantuje buňky/xenografty ESCC do dolního konce jícnu v břišní oblasti poblíž gastroezofageální junkce. Nedávno jsme také uvedli srovnání přežití zvířat s ortotopickým nádorem vyvinutým v horní oblasti jícnu a v dolní oblasti a zjistili jsme, že zvířata s nádorem v břišní oblasti mají lepší přežití . Ačkoli je založení ortotopických nádorů časově i pracovně náročnější, může tento model umožnit studium růstu nádoru ve správném nádorovém mikroprostředí jako v klinické situaci a umožnit studium interakcí mezi nádorem a stromatem . Trpí však stejným omezením jako subkutánní model, neboť jako zdrojový materiál pro založení nádoru používá buněčné linie ESCC. Další velkou nevýhodou tohoto modelu je nutnost používat specializované zobrazovací metody, např. zobrazovací systém in vivo spojený s použitím bioluminiscenční technologie , pro sledování růstu nádoru. Navzdory těmto omezením je tento model díky svým silným stránkám cenným zvířecím modelem pro použití ve střední až pozdní fázi výzkumu.

Ačkoli ortotopický model nádorového xenotransplantátu nabízí ve srovnání se subkutánním modelem vyšší výhody, jeho použití zůstává omezené kvůli výše uvedeným omezením. Navzdory těmto nedostatkům se rozšiřuje počet zpráv, které jsou příkladem použití tohoto modelu pro studium tumorigeneze ESCC a pro provádění preklinických testů protinádorové účinnosti. Když byl tento model použit k odhalení tumor potlačujícího účinku transmembránové proteázy DESC1, byla při použití buněk KYSE-150 ESCC exprimujících DESC1 pozorována pomalejší rychlost růstu nádoru ve srovnání s buňkami používajícími kontrolní buňky . V nezávislé studii využívající tento model ke zkoumání nádorového fenotypu s nádorem související proteinkinázy AKT byl zjištěn zřejmý nádorový potlačující účinek spojený s knockdownem AKT, takže byla snadno zjištěna snížená rychlost růstu ortotopických nádorů . Kromě použití ke studiu růstu nádorů lze tento model použít ke zkoumání mechanismu nádorové invaze. Komplexní studie poukázala na zapojení povrchové molekuly buněk CD44H do nádorové invaze na základě invazivních vzorců pozorovaných mezi ortotopickými nádory odvozenými z buněk T.T ESCC a invazivním protějškem T.T-1 ESCC. Buněčná linie T.T-1 ESCC exprimovala vysokou hladinu CD44H a byla odvozena z nádorových buněk izolovaných z krčních lymfatických uzlin v ortotopickém modelu xenograftu odvozeného z buněk T.T ESCC . Kromě použití ke studiu růstu a invaze nádoru je tento model schopen posoudit účinky testovaných sloučenin na přežití po léčbě. U zvířat s ortotopickým nádorem ESCC bylo pozorováno prodloužené přežití po léčbě inhibitorem mTOR temsirolimem, který se v současné době používá u karcinomu ledvin .

Obecně ortotopický model nádorového xenograftu doplňuje běžné použití subkutánního modelu pro studium ESCC tím, že poskytuje správné nádorové mikroprostředí. Kromě toho tento model funguje jako nepostradatelný nástroj v preklinickém výzkumu pro zkoumání protinádorových účinků testovaných sloučenin/léků (tabulka 3).

Nádorový xenotransplantační model odvozený od pacienta

Nádorový xenotransplantační model odvozený od pacienta je pro výzkum ESCC pokročilejší zvířecí nádorový model než výše uvedené modely. Tento model je založen na použití nádorů ESCC resekovaných od pacientů k vývoji nádorových xenografů u imunodeficitních zvířat. Nádory pacientů mohou být implantovány subkutánně nebo ortotopicky. V závislosti na místě implantace nádoru si tento model také zachovává určité vlastnosti jako subkutánní a ortotopický model nádorového xenograftu. Pozoruhodné je, že nádorové xenografty získané z pacientských nádorů mají zachované genetické, histologické a fenotypové vlastnosti jako dárcovské nádory. Vzhledem k tomu, že stromální a buněčné složky nádorových xenotransplantátů odvozených od pacienta jsou zachovány jako u dárcovských nádorů, může použití tohoto modelu vyloučit nevýhody spojené s použitím homogenních nádorových buněčných linií. Navzdory těmto výhodám tento model nevyhnutelně trpí několika omezeními . Vytvoření modelu vyžaduje použití resekovaných nádorů pacientů, u nichž některé laboratoře základního výzkumu nemusí mít přístup k tomuto zdroji vzorků. Kromě toho je míra přihojení pacientských nádorů k vytvoření nádorových xenograftů suboptimální a liší se v závislosti na řadě faktorů, jako jsou typy nádorů, místa implantace nádorů, kmeny myší, vlastnosti nádorů a vlastnosti pacientů . Dokonce i u pacientských nádorů, které lze úspěšně vštípit, vyžaduje dlouhou dobu latence, aby se z nich stal nádorový xenograft, a někdy může tento proces trvat až 6 měsíců. Výše uvedená omezení proto způsobila, že proces založení nádoru je vysoce nákladný a pracný. Navzdory těmto nevýhodám tento model postupně nahrazuje jiné zvířecí modely rakoviny, které se používají ve střední a pozdní fázi výzkumu, a je zvláště přínosný pro preklinické hodnocení protinádorové účinnosti nových sloučenin/léků. Tento model je totiž někdy označován jako “klinické testy na myši” díky své vynikající schopnosti předpovídat klinickou odpověď testovaných sloučenin/léčiv v důsledku vysoké podobnosti mezi nádorovými xenografty a dárcovskými nádory .

Vzhledem ke všem výhodám a nevýhodám nám může nádorový xenograftický model odvozený od pacienta poskytnout výzkumnou platformu nejen pro studium mechanismů onemocnění ESCC, ale může také usnadnit preklinický screening léčiv. Pro posledně jmenovanou aplikaci se tento model používá s větší výhodou než subkutánní a ortotopické modely vzhledem k jeho vysoké klinické relevanci, která podporuje jeho použití pro hodnocení protinádorové účinnosti nových sloučenin/léků. V této oblasti si jednotlivé výzkumné týmy vytvořily vlastní sbírky nádorových xenograftových modelů odvozených od pacientů se zachovanou nádorovou heterogenitou pro screening léčiv nebo kombinací léčiv pro ESCC (tabulka 4).

Modely nádorových xenotransplantátů odvozených od pacientů s dobře charakterizovanými molekulárními deregulacemi, které se běžně vyskytují u ESCC, lze použít jako nástroj pro testování v současnosti používaných léčiv pro jejich nové použití na ESCC. Tento proces je důležitý, protože může sloužit k výzkumu nových léků pro pacienty, kteří jsou rezistentní na současnou farmakologickou léčbu. Cisplatina a 5-fluorouracil jsou dva chemoterapeutické léky používané u ESCC, avšak ne všichni pacienti mají dobrou odpověď na léky. Aby lépe porozuměli mechanismu působení léků, vytvořili Zhang a spol. panel xenografických modelů nádorů odvozených od pacientů a dobře je charakterizovali z hlediska běžných genetických aberací často detekovaných u ESCC, jako je exprese HER2 a mutace EGFR (receptor epidermálního růstového faktoru), K-ras, B-raf a PIK3CA (fosfatidylinositol-4,5-bisfosfát 3-kináza katalytická podjednotka alfa). Při použití panelu xenografů s dobře charakterizovaným stavem HER2 a PIK3CA ke zkoumání účinku léčby cisplatinou a 5-fluorouracilem byly nádorové xenografy negativní na HER2 a nesoucí divoký typ PIK3CA citlivější k této léčbě ve srovnání s HER2 pozitivními xenografy bez ohledu na mutační stav PIK3CA . Výsledky získané z této studie odhalily souvislost mezi genetickým složením nádoru a odpovědí na chemoterapeutické léky.

Kromě použití modelů nádorových xenograftů odvozených od pacientů s definovaným genetickým složením pro testování konvenčních chemoterapeutických léků byly tyto modely použity ke zkoumání protinádorové účinnosti léků, které se u ESCC klinicky nepoužívají, jako jsou trastuzumab a lapatinib. Testování účinku trastuzumabu na xenograftech nádorů odvozených od pacientů ukázalo, že HER2-pozitivní ESCC reaguje na tuto léčbu, ale ne u těch, které nesou současně mutaci PIK3CA. Další léčba těchto HER2 pozitivních a PIK3CA mutovaných nádorových xenografů inhibitorem AKT AZD5363 následně způsobila, že xenografy opět reagovaly na léčbu trastuzumabem . Jiná studie zkoumala senzitizující účinek lapatinibu na chemoterapeutika oxaliplatinu nebo 5-fluorouracil pomocí modelu nádorových xenograftů odvozených od pacientů. Kombinovaná léčba lapatinibem s 5-fluorouracilem vedla k silnějšímu inhibičnímu účinku na růst než samotný lapatinib nebo jeho kombinovaná léčba s oxaliplatinou . Tyto studie jasně prezentovaly užitečnost těchto modelů pro preklinické testování léčiv. Důležité je, že takové testování na nádorových xenografech s definovaným genetickým pozadím může usnadnit vývoj precizní medicíny výběrem léčiva na základě genetických deregulací nádorů.

Nádorové xenografty odvozené od pacientů mohou napodobit genetickou rozmanitost a složení klinického prostředí díky vysoké histologické a patologické shodě mezi dárcovskými nádory a založenými nádorovými xenografty. Tyto dřívější studie předložily preklinické použití těchto modelů pro hodnocení protinádorové účinnosti různých léčiv/sloučenin (tabulka 3). Odvozené výsledky mohou také poskytnout solidní důkazy podporující použití nových léčiv/sloučenin pro léčbu ESCC. Takové preklinické testy proto tvoří důležitou platformu před klinickými zkouškami.

.