Celkovým cílem tohoto postupu je postupná extrakce RNA a DNA z archivních formalínem fixovaných parafinových tkáňových jader. Toto je protokol pro odběr tkáňových jader, ze kterých budeme extrahovat RNA i DNA. Hlavní výhodou tohoto protokolu je, že zlepšuje výtěžnost RNA a DNA z přesně cílených oblastí v tkáňovém bloku.

Tento postup je z velké části vyvinut v archivních tkáních karcinomu prostaty. Lze jej použít i na jiné typy archivních tkání. Vizuální demonstrace této metody je zásadní, protože kroky korigování tkáně se ve výzkumných laboratořích běžně nepoužívají.

Většina výzkumných laboratoří místo toho používá příčné řezy, které tkáně vyčerpají rychleji a přidávají do vzorku značnou heterogenitu. Začněte prohlížením mikroskopického preparátu a obkreslením oblasti zájmu pomocí permanentního fixu s jemným hrotem. Poté vystřihněte dostatečně velký úsek parafínové fólie, aby pokryl oblast zájmu na mikroskopickém sklíčku.

Poté fólii pevně přiložte na sklíčko a oviňte ji přes okraje, aby nesklouzla. Pomocí permanentního fixu s jemným hrotem obkreslete celou tkáň a oblast zájmu uvnitř tkáně. Poté film sejměte z podložního sklíčka a přeneste jej na odpovídající tkáňový blok.

Převrácením nebo otočením filmu jej orientujte tak, aby obrys celé tkáně odpovídal pozorovanému tvaru tkáně v bloku. Pevně přitiskněte část filmu k povrchu bloku, abyste zabránili sklouznutí. Pomocí hrotu permanentního fixu udělejte mělké, ale viditelné zářezy podél obrysu zájmové oblasti a poté film odstraňte.

Poté očistěte receptorový průbojník ze sady průbojníků o průměru 0,6 milimetru ponořením hrotu do 1,5 mililitrové mikrocentrifugační zkumavky obsahující jeden mililitr bělidla a několikerým posunutím průbojníku nahoru a dolů. Promývání opakujte se zkumavkou obsahující 70 % ethanol a poté s vodou. Nyní zatlačte očištěný průbojník do zájmové oblasti do hloubky tří milimetrů a vytáhněte jej.

Uvolněte jádro do mikrocentrifugační zkumavky s nízkou vazbou jeho vytlačením z průbojníku pomocí hrotu. Do mikrozkumavek obsahujících tkáňová jádra přidejte jeden mililitr xylenu a deset sekund energicky vířete. Poté vložte na tři minuty do tepelného bloku nastaveného na 50 °C.

Po inkubaci centrifugujte dvě minuty při pokojové teplotě maximální rychlostí. Po odstředění umístěte jádra na pět minut na led, aby voskový zbytek ztuhl. Nyní opatrně odstraňte parafín, který se nahromadil kolem menisku, spolu se supernatantem pomocí špičky pipety.

Poté zopakujte ošetření xylenem. Po odstranění směsi parafínu a xylenu přidejte jeden mililitr stoprocentního ethanolu a deset sekund energicky vířete. Po dvouminutovém odstřeďování při maximální rychlosti etanol opatrně zlikvidujte.

Před zahájením homogenizace ještě jednou zopakujte promývání etanolem. Před homogenizací znovu rozpusťte deparafinovaná jádra v 700 mikrolitrech 100% ethanolu. K rozmělnění jader na jemné částice použijte motorizovaný tkáňový homogenizátor se středním nastavením.

Důkladná homogenizace tkáňových jader je nutná pro optimální výtěžnost DNA a RNA. Poté naplňte oddělené 15mililitrové zkumavky přibližně deseti mililitry bělidla, neutralizačního roztoku RNázy a 70 % etanolu. Po homogenizaci vzorku promývejte sondu homogenizátoru v každém z čisticích roztoků v uvedeném pořadí.

V průběhu fáze promývání spusťte homogenizátor na nejvyšší otáčky. Před homogenizací dalšího vzorku otřete sondu kapesníkem a nechte ji zcela vyschnout. Vizuálně zkontrolujte čepele sondy, zda na nich nejsou zbytky kousků tkáně, a pokud je naleznete, sondu znovu vyčistěte.

Po homogenizaci doplňte objem vzorku na jeden mililitr 100 % etanolem a poté odstřeďujte při maximální rychlosti po dobu 15 minut. Před zahájením extrakce proteinázou K opatrně odsajte etanol a pelety sušte na vzduchu přibližně 15 až 20 minut. Pelety znovu rozpusťte ve 150 mikrolitrech rozkladného pufru proteinázy K a třepejte zkumavkami, aby se peleta uvolnila.

Pro vyšší výtěžnost DNA se doporučuje noční rozklad proteinázou K. Přidejte 10 mikrolitrů teplotně stabilní proteinázy K a promíchejte promícháváním. Inkubujte při teplotě 56 °C po dobu 15 minut za mírného míchání.

Inkubujte zkumavky na ledu po dobu tří minut. Po ochlazení zkumavku odstřeďujte 15 minut při maximální rychlosti. Poté bez narušení pelet opatrně přeneste každý supernatant do nové mikrocentrifugační zkumavky pro purifikaci RNA.

Extrahujte RNA a DNA pomocí optimalizovaného postupu v písemném protokolu, který zahrnuje prodlouženou dobu trávení tkáně pro extrakci DNA. Touto metodou lze získat RNA a DNA ze starších vzorků tkání fixovaných ve formalínu a zalitých v parafínu. Nukleové kyseliny byly koextrahovány ze vzorků karcinomu prostaty ve stáří od tří do 14 let.

Průměrný výtěžek byl 2, 270 nanogramů RNA a 820 nanogramů DNA. Zajímavé je, že nebyla zjištěna významná korelace mezi stářím vzorku tkáně a výtěžností nukleových kyselin. Celkově výtěžky RNA a DNA korelovaly napříč vzorky, ačkoli ve většině případů bylo získáno více než dvojnásobné množství RNA v porovnání s DNA.

Pro demonstraci výkonnosti genomové DNA extrahované tímto protokolem byly metylačně specifickou PCR amplifikovány bisulfitem konvertované extrakty DNA z archivních vzorků rakoviny prostaty. Jako kontrola metylace byly použity ALU repetitivní elementy, které vykazovaly malé rozdíly mezi vzorky. GSTP1, gen, o němž je známo, že je u karcinomu prostaty hypermetylován, nevykazoval při použití DNA extrahované z benigních vzorků žádnou detekovatelnou amplifikaci pomocí metylačně specifické PCR.

Ve vzorcích DNA od pacientů s agresivním karcinomem prostaty byly detekovatelné prahové hodnoty cyklu QPCR nižší než v buňkách indolentního karcinomu prostaty, což svědčí o zvýšené metylaci GSTP1 u agresivního karcinomu prostaty. Po zvládnutí této techniky ji lze u RNA provést během tří až čtyř hodin a po nočním rozkladu během čtyř hodin u DNA, pokud je provedena správně. Tato technika by měla výzkumníkům v molekulární patologii umožnit zkoumat diagnostické biomarkery DNA a RNA u různých druhů rakoviny.

Po zhlédnutí tohoto videa byste měli dobře rozumět tomu, jak připravit tkáňová jádra pro extrakci DNA a RNA z přesně zmapovaných oblastí zájmu v archivních tkáňových blocích.