Diskuse

Lidská mikrobiota zahrnuje více než tisíc různých druhů bakterií a hraje významnou roli v lidském zdraví tím, že podporuje přísun živin, brání kolonizaci patogeny a formuje a udržuje normální slizniční imunitu. Komenzální střevní bakterie jsou v poslední době oceňovány jako ty, které mají s hostitelem skutečný symbiotický vztah ; v rámci tohoto velkého souboru bakterií se uvádí, že probiotické doplňky obsahující LAB (tj. laktobacily a bifidobakterie) mají řadu příznivých účinků na lidské zdraví, jako je prevence průjmů a zánětlivých střevních onemocnění nebo profylaxe urogenitálních infekcí . Naše znalosti o biochemických rolích, které konkrétní druhy a kmeny hrají v lidském zdraví a nemoci, jsou však značně omezené. V této studii jsme se zaměřili na prohloubení znalostí o cestách redukce dusičnanů u vybraných běžných bakteriálních druhů kolonizujících lidské střevo za použití in vitro podmínek kompatibilních se stravou bohatou na dusičnany a hladinami kyslíku zjištěnými na slizničním povrchu trávicího traktu. Hlavní výsledky našeho šetření ukazují, že: 1) E.coli, fakultativní anaerob, přeměňuje dusičnany na dusitany a následně na amoniak, který se postupně hromadí v kultivačním médiu; 2) L.plantarum, fermentativní bakterie, pěstované v přítomnosti exogenního hemu a vitaminu K2 provádějí podobné procesy; 3) enzymy E.coli vytvářejí významný NO z dusitanů pouze za anaerobních podmínek; 4) všechny zkoumané kultury LAB vytvářejí velké množství kyseliny mléčné, což způsobuje dostatečné okyselení kultivačního média, které vede k disproporcionaci dusitanů na NO.

Většina eukaryot získává energii především oxidativní fosforylací a musí dýchat O2 pro tvorbu ATP, avšak mnoho střevních bakterií, včetně kmenů E.coli K12, může používat NO3- jako alternativní akceptor elektronů, když je O2 limitující a dusičnanů je dostatek . E.coli představuje modelového člena čeledi Enterobacteriaceae, a přestože tato čeleď tvoří pouze malou část střevní mikroflóry, je obzvláště důležitá, protože některé kmeny mohou způsobovat onemocnění. Nedávno se také ukázalo, že dusičnany, které vznikají jako vedlejší produkt zánětu hostitele, mohou E.coli využívat při dýchání k tomu, aby poskytly výhodu růstu a předstihly mikroby sídlící v tlustém střevě, které jsou závislé pouze na fermentaci . L. plantarum je považována za bezpečné probiotikum a běžně se vyskytuje ve střevním traktu savců i v lidských slinách, kde se dusičnany, jak známo, hromadí až do milimolárních hodnot díky entero-salivárnímu cyklu dusičnanů, který představuje asi 25 % celkového množství cirkulujících dusičnanů . Tato bakterie představuje typickou fakultativní heterofermentativní dráhu rodiny LAB, ale v genomu L. plantarum WCFS1 byly nedávno identifikovány geny, které kódují předpokládaný nitrát-reduktázový systém (narGHJI), což naznačuje, že je schopna využívat dusičnany jako akceptor elektronů . Nedávno publikovaná genetická analýza L.plantarum totiž poukázala na jeho nesmírně rozmanité a všestranné metabolické schopnosti .

V našich experimentech byla zjištěna významná aktivita nitrátreduktázy jak u E.coli, tak u L. plantarum při poklesu napětí kyslíku z atmosférické hladiny směrem k nule. Naopak B.longum infantis, mikroaero tolerantní anaerob dětského gastrointestinálního traktu, nevykazoval schopnost redukovat dusičnany ani při vysokých koncentracích. Bifidobakterie představují až 90 % bakterií gastrointestinálního traktu kojenců a naše výsledky jsou v souladu s pozorováním, že lidské mateřské mléko, které představuje obzvláště vysoké hladiny dusitanů , poskytuje dietní zdroj dusitanů před vytvořením jazykové a střevní mikroflóry schopné redukovat dusičnany, které se běžně vyskytují ve flóře dospělých.

Na obr. 1 jsme ukázali, že kultury E.coli obsahující 5 mM NO3- mají konkurenční růstovou výhodu vůči kulturám bez přídavku dusičnanů, a poté jsme stanovili vliv gradientů kyslíku a dusičnanů na produkci dusitanů a amoniaku. Naše výsledky ukazují, že přibližně 2,5 mM NO3- při 4% nebo nižším obsahu O2 stačí k indukci exprese enzymů nitrátreduktázy a že po 24 hodinách se nahromadilo značné množství dusitanů jak uvnitř buněk E.coli, tak v kultivačním médiu. Podrobná molekulární analýza regulace bakteriálních enzymatických aktivit přesahuje rámec této studie, nicméně je dobře známo, že kmeny E.coli K12 exprimují tři nitrátreduktasy obsahující molybden a že wolfram může tyto enzymy deaktivovat nahrazením atomu molybdenu v aktivním místě . Zjistili jsme, že přídavek 300 μM oxidu wolframu ke kulturám pěstovaným jako v pokusech uvedených na obr. 1 téměř úplně zrušil tvorbu dusitanů (údaje nejsou uvedeny). Domníváme se tedy, že za rozhodující krok při tvorbě dusitanů jsou odpovědné molybden dependentní nitrátreduktasy. Je také důležité poznamenat, že E.coli, stejně jako mnoho dalších druhů bakterií, jsou citlivé na toxicitu dusitanů v důsledku tvorby komplexů kov-nitrosyl a tuto toxicitu minimalizují koordinovanou indukcí membránového transportéru dusitanů a dalších enzymů, které zprostředkovávají redukci dusitanů. Úplný popis genů a operonů regulace a exprese enzymů nitrátové a nitritové reduktázy E.coli lze nalézt ve vynikajících publikacích Stewarta a Colea .

Druhy redukce oxidů dusíku v lidském střevě

Přítomnost dusičnanů a dusitanů v dolní části trávicího traktu závisí na mnoha aspektech včetně typů bakterií kolonizujících střevo a složité rovnováhy mezi stravou a metabolickými drahami oxidů dusíku. Již dlouho je však známo, že endogenní produkce dusičnanů z oxidace NO (hlavně prostřednictvím reakce s oxy-hemoglobinem) je řádově vyšší než příjem potravou, jak bylo prokázáno koncem 70. let 20. století a nedávno ve studiích využívajících myši s deficitem eNOS . Ve schematickém znázornění na obr. 5 jsme shrnuli souvislost mezi bakteriální respirační denitrifikací, redukcí oxidů dusíku na amoniak, endogenní cestou L-argininu/NO syntázy a neenzymatickou redukcí dusitanů na NO. V procesu denitrifikace (červený rámeček) se dusičnany redukují na plynný dusík (N2) ve čtyřstupňovém procesu, v němž jsou dusitany, NO a oxid dusný akceptory elektronů v reakcích generujících energii. Nedávno byla prokázána existence kompletní denitrifikační cesty vedoucí k produkci N2 v lidském zubním plaku, a přestože je u člověka stále považována za málo významnou, spekulujeme, že by mohla mít důležitou roli při velmi nízkém napětí kyslíku v přítomnosti dusičnanů a tvorbu N2 nelze v lidském střevě vyloučit. Denitrifikace a disimilační redukce dusičnanů na amoniak (DNRA, modrý rámeček) mají společný první krok redukce dusičnanů na dusitany a s touto reakcí je spojeno několik tříd nitrátreduktáz. Při DNRA je druhým krokem přímá redukce dusitanů na amoniak šesti elektrony, která neposkytuje energii, ale je poměrně běžným detoxikačním procesem u fakultativně anaerobních bakterií. Předpokládá se, že DNRA představuje hlavní cestu metabolismu dusičnanů v bachoru savců . Tato studie identifikovala amoniak jako produkt redukce dusičnanů u bakterií E.coli a Lactobacilli pěstovaných v přítomnosti mM dusičnanů při 4% obsahu kyslíku nebo nižším.

Rozbalit

Respirační denitrifikace může také vytvářet malé, ale významné množství NO jako meziproduktu a byla zapojena do bakteriální produkce NO ve střevě . Dalšími možnými cestami poskytujícími NO jsou kyselá přeměna nitritů (zelený rámeček) a oxidace L-argininu enzymy NOS (hnědý kroužek). Na obr. 4C jsme zkoumali protonovou závislost neenzymatické disproporcionace dusitanů a ukázali jsme, že se stává relevantní pouze tehdy, když je pH intracelulárních nebo tělních tekutin nižší než 5,5. Na obr. 4C je znázorněno, jakým způsobem dochází k disproporcionaci dusitanů. Naše výsledky také vyloučily přítomnost aktivních enzymů NOS v E.coli a L.plantarum, nicméně je známo, že střevní epiteliální buňky produkují NO prostřednictvím exprese endoteliální i indukovatelné izoformy NOS. Zajímavé je, že produkce NO ve střevě by mohla být vyvolána také enzymatickými procesy peroxidáz, které jsou hojně zastoupeny na buňkách střevní sliznice a bylo prokázáno, že využívají dusitany jako substrát k produkci NO v rámci svého antibakteriálního působení.

Domníváme se, že všechny tyto různé cesty redukce dusičnanů mohou existovat současně a probíhat současně, je však pravděpodobné, že v závislosti na konkrétních fyziologických podmínkách bude převažovat pouze jeden metabolit.

Fyziologický význam tvorby NO bakteriální redukcí dusičnanů

Dusičnany a dusitany jsou v mnoha studiích stále zobrazovány jako možné toxické látky, přestože přibývá důkazů, že tvorba NO z těchto iontů má důležité příznivé důsledky pro kardiovaskulární, imunitní a gastrointestinální funkce . Ve střevě plní NO několik fyziologických funkcí, jako je regulace průtoku krve sliznicí, pohyblivosti střeva a tloušťky hlenu. Chronická nadprodukce NO je také spojována se zánětlivými střevními onemocněními a pravděpodobně inhibuje růst celé řady bakteriálních druhů. Předchozí studie ponechávaly nejasné, jak střevní bakterie produkují NO, nicméně Sobko a spol. ukázali, že na rozdíl od běžných potkanů jsou hladiny NO ve střevě bezbakteriálních potkanů extrémně nízké a při inokulaci normální bakteriální flóry se pozorovaná produkce NO zvýšila 10krát.

V našich pokusech určovaly koncentrace kyslíku a protonů specifickou cestu redukce nitrátů na NO. Výsledky uvedené na obr. 4A naznačují, že E.coli je schopna enzymatické aktivity NO za anaerobních podmínek s koncentrací dusičnanů vyšší než 1 mM pravděpodobně prostřednictvím denitrifikace nebo periplazmatického enzymu cytochrom c nitritreduktázy (Nrf), jak navrhli Corker a Poole . Tato tvorba NO se však při 2 % kyslíku výrazně snižuje a stává se nezávislou na dusičnanech. Důležité je, že naše údaje jsou v souladu se zprávou Sobka a kolegů, že E. coli generovala nevýznamné množství NO během 24hodinové inkubace s 0,1 mM dusičnanem . LAB produkovala značné množství NO v reakci na okyselení média v důsledku akumulace kyseliny mléčné. Nahrazení růstového média čerstvým LMRS (pH = 6,5) téměř zcela zablokovalo schopnost kultur LAB přeměňovat dusitany na NO, nikoli však u E.coli. Měření střevního pH se pohybuje v rozmezí 5,7 až 7,5, disproporce dusitanů in vivo je tedy pravděpodobně menším a lokalizovaným aspektem produkce NO. Naopak, tato cesta je dobře známým jevem v kyselém prostředí žaludku (pH kolem 3).

Shrnem se domníváme, že NO generovaný střevními bakteriemi v blízkosti střevní sliznice může buď vykonávat výše uvedené příznivé účinky, nebo při vyšších hladinách tyto funkce narušovat. Bakteriální tvorbu NO ve střevě lze tedy považovat za modulátor jak fyziologických, tak patologických účinků.

Fyziologické důsledky bakteriální tvorby amoniaku pro zdraví

O tom, že střevní bakterie produkují amoniak z deaminace aminokyselin nebo prostřednictvím ureázy, hydrolýzy močoviny na oxid uhličitý a amoniak, se ví již od zásadních studií Vince et al. z počátku 70. let 20. století . Nedávno Cole a kolegové uvedli, že hlavním produktem redukce dusitanů u E.coli je amoniak, přičemž asi jen 1 % se redukuje na NO při neutrálním pH . Výsledky získané v naší studii naznačují, že přinejmenším některé běžné střevní bakterie primárně redukují dusitany spíše na amoniak než na NO . U zdravých osob je za běžných fyziologických podmínek většina amoniaku vzniklého v dolní části trávicího traktu následně vyloučena do tělních tekutin a metabolizována jaterními hepatocyty, kde se amoniak a oxid uhličitý enzymaticky přeměňují na karbamoylfosfát, který vstupuje do série reakcí nazývaných “močovinový cyklus” vedoucí k tvorbě močoviny a jejímu vyloučení ledvinami (viz obr. 5). Normální plazmatická koncentrace amoniaku se pohybuje v rozmezí 10-35 μM, avšak při nadměrné produkci amoniaku může amoniak přenášený portální krví obejít játra, což vede k hyperamonemii . Amoniak v krvi volně prostupuje hematoencefalickou bariérou a vysoké hladiny (>100 μM) mají toxické účinky na centrální nervový systém, což vede k encefalopatii a nakonec ke kómatu. U pacientů s jaterní cirhózou se velmi často rozvíjí jaterní encefalopatie (HE) . Při absenci jaterního selhání bylo hyperamonemické kóma přisuzováno sepsi způsobené mikroorganismy schopnými ureázy, jako je Klebsiella pneumonia . Klasické terapeutické přístupy k HE zahrnují snížení systémové hladiny amoniaku pomocí antibiotické léčby (k usmrcení střevních bakterií produkujících amoniak) a podávání nevstřebatelných cukrů, jako je laktulóza a laktitol . V tlustém střevě se laktulosa působením bakterií tlustého střeva rozkládá především na kyselinu mléčnou a také na malé množství kyseliny mravenčí a octové . Toto okyselení podporuje tvorbu nevstřebatelného amonného iontu z amoniaku a snižuje jeho koncentraci v plazmě. Není jasné, jakou měrou přispívají dietní dusičnany ke koncentraci amoniaku ve střevě a v krvi, nicméně navrhujeme alternativní hypotézu, že zvýšené okyselení obsahu tlustého střeva v důsledku přítomnosti laktulózy podporuje přeměnu dusitanů mikrobiotou na NO místo amoniaku známým mechanismem závislým na kyselinách.

Závěry

Po více než 30 let nebylo možné zohlednit biologický osud exogenních dusičnanů ve vyloučených sloučeninách obsahujících dusík, které u člověka představují přibližně 60 % požité dávky dusičnanů. Naše výsledky podporují myšlenku, že bakterie ve slinách, žaludku, tenkém a tlustém střevě přeměňují dusičnany na dusitany a následně na další redukované biomolekuly dusíku, jako je NO, amoniak, močovina a případně plynný dusík. Otázky, jako například kolik amoniaku vzniká redukcí dusičnanů na dusitany oproti jiným důležitým procesům, jako je deaminace a aktivita bakteriálních ureáz, vyžadují podrobné metabolické studie u zvířat a/nebo lidí. Biologický význam přeměny dusičnanů z potravy ve střevním lumen musí být ještě stanoven. Nicméně tradiční japonská a středomořská strava, o nichž je známo, že mají kardiovaskulární ochranné účinky, mají průměrný příjem dusičnanů na osobu 2 až 3krát vyšší než typická západní strava (ve Spojených státech odpovídá asi 40-100 mg/den dusičnanů). Je třeba dále zkoumat souvislost mezi symbiotickými bakteriemi, metabolismem oxidů dusíku a lidským zdravím; je však zřejmé, že biologické cesty metabolismu dusíku u savců jsou složitější a důležitější, než se ještě před několika lety předpokládalo.

.