Buněčný cyklus podél primárního kořene kukuřice

Primární kořen kukuřice byl podle předchozích výsledků (Alarcón et al., 2016) rozdělen na po sobě jdoucí segmenty, které označovaly hranice kořenové čepičky, zóny prodlužování apikálního meristému a diferenciační zóny. Vzdálenost od RCJ k vrcholu kořene byla odhadnuta na 457 µm, což bylo odstraněno před rozdělením kořene na několik zón. Kořenová apikální meristematická zóna (MZ) se nachází v nejvrchnější části kořene 1,5 mm od RCJ a přechodová zóna (TZ) pokračovala do 3 mm. Zóna rychlého prodlužování (EZ), kde se buňky rychle prodlužují, byla přiřazena k 3-6 mm; a v oblastech vzdálených od 6 mm jsme pozorovali, že rychlost prodlužování buněk začíná klesat, což naznačuje zónu ukončení růstu (Verbelen et al., 2006). Zóny umístěné 12-20 mm a 20-30 mm od RCJ jsou diferenciační zóny (DF), kde boční kořeny zahajují svůj vývoj. Podobné rozčlenění kořenů bylo provedeno u Arabidopsis, kde byl kořen rozčleněn na pět částí, které jsou kratší než u kořene kukuřice (Cools et al., 2010). Nedávno byla zaznamenána rozdílná exprese genů podél kořene Arabidopsis a potlačené nebo indukované geny se liší především při změně z meristematické do přechodové zóny a také z přechodové do elongační zóny (Chaiwanon a Wang, 2015).

Hranice kořenového meristému je určena výstupem z buněčného cyklu a rovnováhou mezi buněčným dělením a prodlužováním buněk (Perilli a kol., 2012). Profil průtokové cytometrie ukazuje průběh buněčného cyklu podél primárního kořene a údaje zobrazující počet relativních buněk na jednotlivých fázích buněčného cyklu ukazují aktivitu buněk v několika zónách kořene. Když tedy buňky opustí buněčný cyklus, mohou přestat cyklovat. Kromě toho se obecně předpokládá, že k opuštění buněčného cyklu dochází po mitóze a rozhodnutí o vstupu do nového buněčného cyklu je učiněno v bodě přechodu G1 do S v reakci na růstové faktory a různé hormony (Gutierrez et al., 2002; Inzé a De Veylder, 2006; Polyn et al., 2015).

Na obr. 1 ukazujeme, že u kořenů o velikosti 150-160 mm pěstovaných při 30 °C je meristém prakticky omezen na MZ, zónu 0-1,5 mm od RCJ, kde byl podíl buněk ve fázích G0/G1-, S- a G2/M přibližně 27, resp. 39 (tab. 1). Relativní doba trvání G1, S, G2 a M v meristému Allium byla odhadnuta na 26,5, 44,5, 16,5 a 12,5 % (Giménez-Martín et al., 1977) a tato procenta jsou velmi podobná i u jiných druhů. Ačkoli naše výsledky uvádějí, že meristém kukuřice má nižší procento buněk v S-fázi, hodnoty (23 %) byly dostatečné pro indikaci progrese buněčného cyklu (Reichheld et al., 1999). Tyto relativní podíly se mimořádně změnily při analýze TZ, v této zóně. Procentuální podíly činily 9, 10 a 68 %, a to pro fáze G0/G1, S a G2/M, v uvedeném pořadí. Tento výsledek naznačuje, že buňky začaly opouštět buněčný cyklus, když dosáhly 1,5 mm od RCJ. Procenta v EZ navíc naznačovala, že při 3 mm buňky opouštějí buněčný cyklus (obr. 1, tab. 1). Kromě toho byl pokles procent buněk v G0-G1- a S-fázi kompenzován nárůstem v G2-M (tab. 1, obr. 2). Tyto výsledky jasně ukazují, že buňky zastavují buněčný cyklus, když jsou ve fázi G2.

Uvádí se, že většina typů buněk opouští meristém v G1-fázi a v poslední době je přechod G1 do S spuštěn pouze v buňkách pericyklu pro iniciaci laterálního kořene (Vanneste et al., 2007). U pericyklu Arabidopsis bylo navrženo, že buňky přiléhající k pólům protoxilu pokračují v buněčném cyklu bez přerušení, když procházejí přechodovou, elongační a diferenciační zónou (Dubrovsky et al., 2008). Tyto buňky jsou jediné, které se dělí a iniciují tak vznik postranních kořenových primordií. Zbytek buněk tvořících kořen se však nedělí. Buňky epidermis a kůry, které tvoří většinu kořenových tkání, pak nepokračují v cyklu, když opustí kořenový meristém.

V naší analýze jsme pozorovali pozoruhodný nárůst počtu buněk ve fázi G2 v TZ a EZ. Tento výsledek naznačuje, že buňky opouštějící meristém ve fázi G2 nepodléhají mitóze, ale zastavují se v této fázi G2 a zůstávají v ní. Předpokládáme, že buňky, které opustí meristém ve fázi G1 nebo S, pokračují v buněčném cyklu až do fáze G2, kde se zastaví. Vychází to z pozorování, že pokles procenta buněk v G0/G1 mezi MZ a TZ (29,7 %) je kompenzován nárůstem v G2 (28,8 %) (tab. 1, obr. 2). Slabého poklesu procenta G2 je dosaženo mezi EZ a bazálním koncem DZ (20-30 mm od RCJ). Tento malý pokles je spolu s poklesem hyperploidních jader kompenzován zvýšeným množstvím hypoploidních jader (tab. 1).

Na druhé straně bylo zjištěno, že TZ ve vrcholovém kořeni kukuřice nejsou zapojeny do mitotického dělení a v této zóně se postmitotická jádra nacházejí v centrální poloze uvnitř buňky (Baluška et al., 2001). Kromě toho nebyly pozorovány žádné mitotické figury podél kořenové zóny; iniciace primordií postranních kořenů byla pozorována mezi 20-25 mm od RCJ (Alarcón et al., 2016). U Arabidopsis je průměrná vzdálenost k nejranější mitóze v pericyklu 3194 µm a první mitóza byla pozorována ve vzdálenosti 2205 µm od kořenové špičky (Dubrovsky et al., 2001). U kořene kukuřice se teprve ve vzdálenosti 20-30 mm od RCJ u některých buněk pericyklu naproti xylému objevila kondenzovaná cytoplazma, což naznačuje, že znovu vstupují do buněčného cyklu (Alarcón et al., 2016). Tyto rozdíly mohou být způsobeny větší rychlostí prodlužování kořenů u kukuřice, která roste 80-90 mm/den, zatímco Arabidopsis prodlužuje pouze 10 mm/den (Dubrovsky et al., 2001).

Pomocí tkáňově specifické kvantitativní mikroskopické analýzy bylo prokázáno, že některé buňky kůry a epidermis byly na začátku svého prodlužování v prvním endocyklu (obsah DNA mezi 4C a 8C). Jádra metaxylemových elementů v přechodové zóně navíc na počátku své rychlé elongace absolvovala jeden nebo dva endocykly dosahující 32C (Baluška, 1987, 1990; Baluška a Kubica, 1984; Baluška et al., 1995). Nedávno bylo popsáno, že k endoreduplikaci dochází u rostlin ještě před zahájením diferenciace buněk (De Veylder et al., 2007). My jsme však nepozorovali relevantní počet jader s ploidní úrovní vyšší než 4n. Navíc, pokud by endoreduplikace byla běžným procesem v kořenové špičce kukuřice, očekávali bychom, že hyperploidie bude narůstat s tím, jak budeme analyzovat zóny vzdálenější od RCJ. Hyperploidie se však v zónách prodloužení nejenže nezvyšovala, ale naopak se snižovala (tab. 1).

Uvádí se, že buňky pericyklu zůstávají v G1-fázi, dokud znovu nevstoupí do buněčného cyklu (Vanneste et al., 2007). Buňky pericyklu však představují jen malou část celkového množství buněk, které tvoří kořenové špičky; nejhojnějším typem buněk ve vrcholu kořene jsou buňky epidermis a kůry. Jestliže tedy přibližně 70 % celkového počtu buněk opouští meristém ve fázi G2, musí být většina epidermálních a kortexových buněk při opouštění meristému ve fázi G2. Předpokládá se, že prodlužování epidermálních a kůrových buněk řídí podélný růst kořene (Alarcón et al., 2014b). Proto by buňky zapojené do procesu diferenciace, jehož výsledkem je prodlužování kořene, měly být ve fázi G2

.