VÝSLEDKY A DISKUSE
Buněčná linie melanomu A375 s konstitutivně aktivovanou MAPK v důsledku mutace BRAFV600E byla ošetřena inhibitorem MEK U0126 v koncentraci 25 μM po dobu 8 h, což vedlo k potlačení fosforylace ERK (obr. 1 a). Imunosupresivní mRNA rozpustných faktorů, včetně IL-6, IL-10 a VEGF, se při léčbě U0126 významně snížila (obr. 1 b), zatímco kontrolní léčba DMSO neovlivnila produkci mRNA IL-10 a VEGF a pouze mírně zvýšila hladinu mRNA IL-6. Osmnáctihodinová expozice U0126 rovněž potlačila produkci IL-10, VEGF a IL-6 na úrovni proteinů, což naznačuje, že aktivované ERK mohou být zodpovědné za potlačení lokální imunitní odpovědi proti melanomu produkcí těchto imunosupresivních faktorů (obr. 1 c). K potlačení fosforylace ERK a inhibici produkce IL-6, IL-10 a VEGF navíc došlo i po snížení koncentrace léčby U0126 na 10 μM (není zobrazeno). Během této studie nebyly při léčbě buněk A375 přípravkem U0126 pozorovány žádné významné cytotoxické účinky. Ačkoli je známo, že U0126 inhibuje kromě MEK1/2 také MEK5, fosforylovaný ERK5, substrát MEK5, nebyl v buňkách A375 zjištěn (není zobrazeno), což naznačuje, že za účinky pozorované při léčbě U0126 je zodpovědná dráha MEK1/2-ERK1/2. Supresivní účinky U0126 na produkci IL-10 a VEGF byly prokázány také u tří dalších buněčných linií melanomu s mutací BRAFV600E, 624mel, 888mel a 928mel, aniž by došlo k významné buněčné toxicitě (obr. 1 d). Protože tyto melanomové buněčné linie neprodukují IL-6, zdá se, že aktivovaná signalizace MAPK má obecnou úlohu v produkci imunosupresivních faktorů IL-10 a VEGF u melanomových buněčných linií BRAFV600E+.
Snížení produkce imunosupresivních rozpustných faktorů IL-6, IL-10 a VEGF z melanomových buněčných linií s konstitutivně aktivní MAPK prostřednictvím mutace BRAFV600E inhibicí signalizace MAPK pomocí inhibitoru MEK, U0126. (a) Inhibice fosforylace ERK1/2 byla zjištěna pomocí Western blot analýzy buněčné linie melanomu A375mel s mutací BRAFV600E před a 2, 4, 6 a 8 h po léčbě inhibitorem MEK U0126 o koncentraci 25 μM. (b) Inhibice exprese mRNA pro imunosupresivní rozpustné faktory IL-6, IL-10 a VEGF v buňkách A375. Kvantitativní RT-PCR byla měřena mRNA pro různé rozpustné faktory, včetně IL-6, IL-10 a VEGF, před léčbou a 2, 4, 6 a 8 h po léčbě přípravkem U0126. Kontrolní léčba byla provedena roztokem DMSO. Hladiny mRNA v každém časovém bodě byly normalizovány na mRNA GAPDH a uvedeny jako relativní hodnota vůči hodnotě z 0 h. (c) Snížená produkce proteinů IL-6, IL-10 a VEGF z buněk A375 po 18hodinové léčbě přípravkem U0126 o koncentraci 25 μM. Exprese byla zjišťována metodou ELISA s kultivačními supernatanty. Poměr životaschopnosti buněk ošetřených U0126 a buněk ošetřených DMSO při sklizni byl 77 %. Produkce cytokinů byla normalizována na hodnotu kontrolních buněk ošetřených DMSO na základě počtu buněk. Western blot prokázal silnou inhibici fosforylace ERK, nikoli však proteinu STAT3 nebo jeho fosforylace na Ser727 a Tyr705. (d) Snížená produkce IL-10 a VEGF ze tří buněčných linií melanomu s mutací BRAFV600E, 624mel, 888mel a 928mel po 18hodinové léčbě přípravkem U0126 o koncentraci 25 μM, která byla zjištěna metodou ELISA se supernatanty z kultury. Poměr životaschopnosti buněk ošetřených U0126 a buněk ošetřených DMSO při sklizni byl 95 % pro 624mel, 103 % pro 888mel a 100 % pro 928mel. Produkce cytokinů byla normalizována na hodnotu kontrolních buněk ošetřených DMSO na základě počtu buněk. Western blot prokázal silnou inhibici fosforylace ERK, nikoli však proteinu STAT3. Mírný pokles fosforylace Ser727 STAT3 byl pozorován u buněk 888mel a 928mel, ale ne u buněk 624mel. Tyto výsledky jsou reprezentativní pro tři nebo čtyři nezávislé experimenty s podobnými výsledky.
Na základě těchto experimentů však nelze zcela vyloučit nespecifické účinky U0126 na produkci cytokinů prostřednictvím jiných drah než signalizace MAPK, protože u 888mel a 928mel byl pozorován mírný pokles fosforylace STAT3 na Ser727 (obr. 1 d). Pro potvrzení role aktivované MAPK v důsledku mutace BRAFV600E v produkci IL-10, VEGF a IL-6 byla do tří melanomových buněčných linií, A375, 888mel a 624mel, transfekována RNAi specifická pro BRAFV600E pomocí lentivirové exprese krátké vlásenkové RNA (shRNA) specifické pro BRAFV600E (11). BRAFV600E specifická RNAi významně inhibovala produkci IL-10, VEGF a IL-6 a potlačila fosforylaci ERK (obr. 2). Tyto výsledky potvrzují, že inhibice těchto faktorů pomocí U0126 (obr. 1) souvisí se specifickou inhibicí dráhy MAPK. Tyto výsledky jsou v souladu s nedávnými pracemi, které ukazují produkci IL-10 indukovanou ERK1/2 v myších makrofázích (12) a produkci VEGF závislou na BRAFV600E pro podporu angiogeneze (13).
Snížení produkce imunosupresivních faktorů IL-6, IL-10 a VEGF ze tří buněčných linií melanomu s mutací BRAFV600E pomocí RNAi specifické pro BRAFV600E. Tři melanomové buněčné linie s mutací BRAFV600E, A375mel, 888mel a 624mel, byly infikovány lentivirovými vektory kódujícími krátkou vlásenkovou RNA pro mRNA světlušky luciferázy (GL3B; jako kontrola) nebo mRNA BRAFV600E (BRAF#1′) při 50 nebo 100násobné infekci. Po 5 nebo 6 dnech po infekci byly extrahovány proteiny a podrobeny Western blot analýze. Při použití RNAi specifické pro BRAFV600E byl pozorován výrazný pokles fosforylace ERK1/2 s poklesem proteinu BRAF. Nebyl pozorován žádný významný rozdíl v proteinu STAT3 a fosforylaci STAT3 na Ser727 nebo Tyr705. Mírný pokles fosforylace na Ser727 byl pozorován u buněk 888mel a 624mel po BRAF RNAi. Po 5 nebo 6 d po infekci lenvirem byl stejný počet melanomových buněk dávkován v hustotě 1-2 × 106 buněk/2 ml a kultivační supernatanty po 18 h byly podrobeny testu ELISA na IL-6, IL-10 nebo VEGF. Byl pozorován výrazný pokles IL-6, IL-10 a VEGF. Je uveden jeden reprezentativní výsledek dvou nebo tří nezávislých experimentů s podobnými výsledky.
Protože bylo zjištěno, že aktivovaná signalizace STAT3 má za následek imunitní únik z rakoviny prostřednictvím produkce různých faktorů včetně VEGF (8, 9), zkoumali jsme vztah mezi drahami MAPK a STAT3 týkající se produkce imunosupresivních faktorů v buněčné linii melanomu A375. Produkce IL-6, IL-10 a VEGF byla hluboce inhibována RNAi cílenou buď na samotný BRAFV600E, nebo na samotný STAT3 (obr. 3 a). Současným omezením drah BRAF-MAPK a STAT3 nebyl pozorován žádný zřetelný aditivní nebo synergický účinek (obr. 3 a). RNAi BRAFV600E v buňkách A375 nesnížila vazebnou aktivitu STAT3 na DNA (obr. 3 b), promotorovou aktivitu STAT3 (obr. 3 c) ani fosforylaci STAT3 na Ser727 nebo Tyr705 (obr. 2), ačkoli se uvádí, že ERK je potenciálně schopna fosforylovat STAT3 na Ser727 (14). K fosforylaci STAT3 však může docházet i cestou nezávislou na ERK (15). V buňkách 624mel sice došlo k mírnému poklesu Ser727-fosforylovaného STAT3, ale aktivita vazby na DNA (obr. 3 b) a aktivita promotoru STAT3 (obr. 3 c) nebyly RNAi BRAFV600E ovlivněny (obr. 2). U buněk 888mel došlo k podobnému poklesu fosforylace Ser727, ale naopak se po RNAi BRAFV600E snížila jak vazebná aktivita STAT3 na DNA (obr. 3 b), tak promotorová aktivita STAT3 (obr. 3 c) (obr. 2). Tyto výsledky naznačují, že snížení transkripční aktivity STAT3 není hlavním mechanismem generujícím potlačení imunosupresivních faktorů snížením regulace signalizace MAPK v těchto melanomových buněčných liniích.
Inhibice produkce IL-6, IL-10 a VEGF v buňkách A375 prostřednictvím RNAi pro samotný BRAFV600E, samotný STAT3 nebo oba, aniž by došlo k významným změnám ve vazbě DNA a promotorové aktivitě STAT3. (a) Výrazná inhibice produkce IL-6, IL-10 a VEGF v buňkách A375 prostřednictvím RNAi pro samotný BRAFV600E, samotný STAT3 nebo obojí. Po 5 nebo 6 dnech po infekci byl stejný počet buněk dávkován v hustotě 106 buněk/2 ml a kultivační supernatant byl po 18 hodinách podroben testu ELISA na IL-6, VEGF a IL-10. Snížení BRAF a fosforylovaného ERK1/2 pomocí RNAi specifické pro BRAFV600E a snížení STAT3 pomocí RNAi specifické pro STAT3 bylo potvrzeno analýzou Western blot. Je uveden jeden reprezentativní výsledek šesti nezávislých experimentů s podobnými výsledky. (b) Žádná významná změna vazebné aktivity STAT3 na DNA inhibicí signalizace MAPK pomocí BRAF RNAi v melanomových buněčných liniích. Aktivita vazby STAT3 na DNA byla zkoumána pomocí EMSA jaderných extraktů z melanomových buněčných linií s kontrolním GL3B nebo s vektorem BRAF#1′ shRNA. Specifické pásy STAT3 označené šipkami zmizely při použití studené DNA sondy STAT3 divokého typu (wt), ale ne při použití DNA sondy mutantního STAT3 (mt). V buňkách 888mel byl pozorován pouze mírný pokles vazebné aktivity STAT3 DNA. (c) STAT3 reportérové testy v buňkách A375, 624mel a 888mel. 2-4 × 105 buněk s kontrolním nebo BRAF#1′ shRNA vektorem bylo transfekováno 0,4 μg pSTAT3-TA-Luc a 0,4 μg pRL-SV40 pomocí Effectene Transfection Reagent. Po 24 hodinách od transfekce byly buňky odebrány a analyzovány na aktivitu světlušky a renilla luciferázy. Každá aktivita světlušky luciferázy byla normalizována s aktivitou renilla luciferázy. Stínované sloupce a chybové úsečky označují průměr a směrodatnou odchylku trojnásobných testů. Je zobrazen jeden reprezentativní pokus ze tří nebo čtyř nezávislých experimentů. Transkripce řízená STAT3 se po BRAF RNAi u A375 a 624mel nezměnila, ale u 888mel se mírně snížila.
Dále byly zkoumány možné účinky způsobené rozpustnými faktory indukovanými MAPK a STAT3 signalizací v supernatantu kultur A375 na zrání DC. Supernatant z kultivovaných melanomových buněk A375 obsahuje rozpustné faktory, které inhibují zrání lidských DC odvozených od monocytů (MoDC) při stimulaci ligandy receptorů podobných Toll, jako je LPS. Přidání supernatantu z kultury A375 ke kulturám MoDC v konečné koncentraci 10-20 % významně snížilo produkci zánětlivých cytokinů, včetně IL-12 a TNF-α, u MoDC, stejně jako povrchových buněčných molekul CD1a a CD83, ale nikoli CD80, CD86, CD40 nebo HLA-DR na MoDC. Supernatanty z ostatních tří buněčných linií melanomu poskytly po přidání ke kulturám MoDC stejné výsledky (není zobrazeno). Supresivní aktivita supernatantů melanomových buněk vychází z produkce IL-6, IL-10 a VEGF, protože přidání specifických protilátek pro tyto faktory snížilo supresivní aktivitu supernatantů kultury A375 (obr. 4 a). Rozdíly mezi našimi pozorováními a dříve popsanými výsledky týkajícími se supernatantu buněk myšího melanomu B16 s aktivovaným STAT3 potlačujícím expresi MHC třídy II a CD40 lze vysvětlit odlišnými nádorovými buňkami nebo druhy (8).
Snížení supresní aktivity supernatantů z kultury melanomu A375 předléčením pomocí RNAi pro samotný BRAFV600E, samotný STAT3 nebo obojí na LPS indukovanou produkci IL-12 a TNF-α z DC. (a) Neutralizace IL-6, IL-10 nebo VEGF v kultivačních supernatantech melanomových buněk A375 obnovila inhibici produkce IL-12 z lidských DC stimulovaných LPS. Lidské MoDC byly kultivovány se supernatanty A375 v přítomnosti nebo nepřítomnosti monoklonální protilátky pro IL-6, IL-10, VEGF nebo izotypové kontrolní protilátky v koncentraci 1 μg/ml. Produkce IL-12 v kultivačních supernatantech byla stanovena metodou ELISA 24 hodin po stimulaci LPS v koncentraci 100 ng/ml. (b) CD14+ monocyty byly izolovány z PBMC pomocí MACS a kultivovány v médiu obsahujícím RPMI 1640, 10 % (obj.) FBS, 100 ng/ml GM-CSF a 50 ng/ml IL-4 s nebo bez 20 % (obj.) kultivačního supernatantu buněk A375mel připraveného v obr. 3. (a) Polovina médií, cytokinů a kultivačního supernatantu byla měněna každé 2 d. Pátý den kultivace byl přidán LPS v koncentraci 100 ng/ml. Po 15 h byly odebrány kultivační supernatanty a podrobeny testu ELISA na IL-12 a TNF-α.
Supresivní aktivita kultivačních supernatantů A375 na produkci IL-12 a TNF-α MoDC ošetřených LPS byla obnovena předúpravou buněk A375 buď pomocí RNAi cílené pouze na BRAFV600E, pouze na STAT3, nebo na BRAFV600E i STAT3 (obr. 4 b). Ačkoli se zdálo, že STAT3 RNAi snižuje supresivní aktivitu supernatantů kultury A375 více než BRAFV600E RNAi, rozdíl může být jednoduše způsoben rozdílnou aktivitou RNAi. Je však důležité poznamenat, že nebyly pozorovány žádné aditivní a synergické účinky RNAi cílených současně na BRAF a STAT3; to opět naznačuje zásadní roli obou signálních drah v produkci supresivních faktorů na zrání DC. Ačkoli byla popsána aktivace DC supernatantem z myší buněčné linie karcinomu tlustého střeva CT26 transfekované dominantně negativní formou STAT3 pravděpodobně prostřednictvím zvýšené produkce prozánětlivých cytokinů, v této studii aktivace DC pozorována nebyla. To lze vysvětlit neúplnou inhibicí BRAF a STAT3, žádnou zvýšenou produkcí prozánětlivých cytokinů u melanomových buněk transfekovaných BRAF shRNA nebo rozdíly v nádorových buňkách či druzích.
Shrneme-li, poprvé jsme prokázali zásadní roli signalizace MAPK spolu s dráhou STAT3 na produkci různých imunosupresivních faktorů u melanomových buněčných linií s konstitutivně aktivní MAPK v důsledku běžné mutace BRAFV600E. Dráha MAPK tak může být potenciálně významným molekulárním cílem pro překonání imunitního úniku u různých typů rakoviny, protože je často aktivována u několika typů rakoviny, včetně melanomu bez mutace BRAFV600E (16, 17).
.