Třída praktická

Měření doby, za kterou amyláza zcela rozloží škrob, odebíráním vzorků v 10sekundových intervalech a zaznamenáváním doby, kdy roztok přestane dávat modročerné zbarvení s roztokem jódu (roztok jódu však zůstává oranžový). Použijte pufry k zajištění roztoků s různým pH. Vypočítejte rychlost této enzymem řízené reakce výpočtem 1÷ čas.

Organizace výuky

Tento postup je dostatečně jednoduchý na to, aby ho mohli provádět jednotlivci, pokud máte dostatek důlkových destiček. Pokud se rozhodnete pro zkoumání pěti pH, pak by mohly zkoumání provést skupiny pěti studentů, kteří by pracovali společně a výsledky by spojili.

Přístroje a chemikálie

Zdravotní & Bezpečnostní a technické poznámky

Roztok amylázy a roztok jódu jsou po přípravě málo nebezpečné. Při manipulaci s roztokem jódu používejte ochranu očí.
Nebezpečnost pufrů se může lišit. Viz karta receptury CLEAPSS nebo informace dodavatele a viz poznámka 3.

1 Amyláza (viz karta nebezpečnosti a karta receptury CLEAPSS) Práškový enzym je NEBEZPEČNÝ, ale roztoky menší než 1 % jsou NÍZKORIZIKOVÉ. Je rozumné v dostatečném předstihu otestovat aktivitu skladovaného enzymu při jeho obvyklé pracovní koncentraci, aby se ověřilo, že se substráty štěpí přiměřenou rychlostí. Enzymy mohou při skladování degradovat, což poskytuje čas na úpravu koncentrací nebo na získání čerstvých zásob. Amyláza pomalu ztrácí aktivitu, proto je nejlepší připravit pro každou lekci čerstvou dávku; dávky se mohou lišit v aktivitě a výsledky získané v různých dnech nebudou srovnatelné. Optimální teplota pro váš enzym je uvedena na štítku dodavatele.

Použití slin: Laboratorní příručka CLEAPSS obsahuje pokyny k opatřením, která je třeba přijmout (včetně hygienických opatření), aby bylo možné bezpečně použít sliny jako zdroj amylázy. Výhodou tohoto způsobu je, že je levnější, nevyžaduje, aby technici každou hodinu připravovali čerstvé roztoky, je pro studenty přímo zajímavý a slinná amyláza je spolehlivá. Poskytuje také příležitost k výuce správných hygienických opatření – včetně zajištění toho, aby studenti používali pouze vlastní vzorky slin (poskytněte malé kádinky, do kterých mohou plivat); aby studenti byli zodpovědní za oplachování vlastního vybavení; a aby veškeré kontaminované sklo bylo umístěno do misky nebo kbelíku s chlorečnanem sodným(I) před tím, než ho technici umyjí.

2 Suspenze škrobu – připravte čerstvou. Připravte krém z 5 g rozpustného škrobu ve studené vodě. Nalijte do 500 cm3 vroucí vody a dobře promíchejte. Vařte, dokud nezískáte čirý roztok. Nepoužívejte modifikovaný škrob.

3 Pufry: (Viz karta s recepty CLEAPSS) Pokud připravíte univerzální pufr, bude obsahovat hydroxid sodný o koncentraci přibližně 0,25 M a měl by být označen jako IRRITANT. Pokud se rozhodnete vyrobit jiné pufry, podívejte se na další příslušné karty nebezpečí nebo na informace od dodavatele, pokud kupujete pufrovací roztoky/tablety. (Poznámka 1)

4 Roztok jódu (viz karta nebezpečnosti a karta receptury CLEAPSS). Pro testování škrobu je vhodný 0,01 M roztok. Připravte jej desetinásobným zředěním 0,1 M roztoku. Po přípravě je roztok málo nebezpečný, ale při rozlití může zabarvit kůži nebo oděv.

Etické otázky

S tímto postupem nejsou spojeny žádné etické otázky.

Postup

BEZPEČNOST: Všechny roztoky jsou po zhotovení málo nebezpečné. Používejte ochranu očí, protože jód může dráždit oči.

Příprava

a Zkontrolujte rychlost reakce s navrženými objemy reaktantů, které se mají použít – 2 cm3 škrobu: V ideálním případě by reakce při tomto pH měla trvat asi 60 sekund: to je obvyklé optimum pro amylázu (viz poznámka 1). Pokud je reakce příliš rychlá, zmenšete objem enzymu nebo zvětšete objem škrobu. Pokud je reakce příliš pomalá, zvyšte objem nebo koncentraci enzymu nebo snižte objem nebo koncentraci škrobu.

Zkoumání

b Umístěte jednotlivé kapky roztoku jódu v řadách na dlaždici.

c Označte zkumavku zkoumaným pH.

d Pomocí injekční stříkačky umístěte do zkumavky 2 cm3 amylázy.

e Pomocí injekční stříkačky přidejte do zkumavky 1 cm3 pufrového roztoku.

f Pomocí další injekční stříkačky přidejte do roztoku amylázy a pufru 2 cm3 škrobu, spusťte stopky a nechte je zapnuté po celou dobu testu. Promíchejte pomocí plastové pipety.

g Po 10 sekundách umístěte pomocí plastové pipety jednu kapku směsi na první kapku jódu. Roztok jódu by se měl zbarvit modročerně. Pokud roztok jódu zůstane oranžový, reakce probíhá příliš rychle a škrob již byl rozložen. Stříkněte zbytek roztoku v pipetě zpět do zkumavky.

h Počkejte dalších 10 sekund. Pak odeberte druhou kapku směsi a přidejte ji k další kapce jódu.

i Krok h opakujte, dokud roztok jódu a směs amylázy, pufru a škrobu nezůstanou oranžové.

j Můžete si připravit kontrolní kapku pro porovnání s testovacími kapkami. Co by měla obsahovat?

k Spočítejte, kolik jste použili jodových kapek, přičemž každá z nich odpovídá 10 sekundám reakčního času.

l Celý postup zopakujte s dalším z použitých pH pufrů, nebo výsledky třídy spojte.

m Zvažte možnost sběru opakovaných údajů, pokud je čas.

n Sestavte graf závislosti času potřebného k rozkladu škrobu na pH nebo vypočítejte rychlost reakce a sestrojte graf závislosti rychlosti na pH.

Poznámky pro učitele

Jedná se o jednoduchý praktický postup poskytující spolehlivé a jednoznačné výsledky. Hlavní chyby budou v pořadí míchání enzymu/substrátu/pufru nebo ve zpoždění při odběru vzorků, takže reakční doba je podhodnocena nebo rychlost nadhodnocena. Kolísání teploty ovlivňuje aktivitu enzymu, takže výsledky získané v různých dnech nejsou srovnatelné.

Zdravotní a bezpečnostní kontrola, září 2008

Ke stažení

Stáhněte si studentský list Zkoumání vlivu pH na aktivitu amylázy (72 KB) s otázkami a odpověďmi.

Webové odkazy

.