Klinický význam

Mikrosatelitní nestabilita (MSI) vzniká systematickým hromaděním delecí/insercí v krátkých repetitivních sekvencích DNA v nádorových buňkách s nedostatečným systémem oprav chyb (MMR). MSI se vyskytuje přibližně u 15 % všech kolorektálních karcinomů a je klinicky užitečná pro identifikaci pacientů s hereditárním nepolypózním kolorektálním karcinomem (HNPCC, Lynchův syndrom) způsobeným zárodečnými mutacemi MMR genů. Stav MSI může také předpovídat odpověď/rezistenci rakoviny na určité chemoterapie.

Ve snaze standardizovat analýzu MSI doporučil seminář Národního onkologického institutu (NCI) v roce 1997 referenční panel pěti mikrosatelitních markerů pro detekci MSI a na základě výsledků stanovil pokyny pro klasifikaci MSI. Referenční panel, označovaný jako panel Bethesda, se skládá ze dvou mononukleotidových lokusů (Big Adenine Tract neboli BAT-25 a BAT-26) a tří dinukleotidových lokusů (D2S123, D5S346 a D17S250). Pomocí panelu Bethesda byly nádory s nestabilitou ve dvou nebo více z těchto lokusů interpretovány jako MSI-high (MSI-H) a nádory bez nestability v některém z pěti lokusů byly považovány za mikrosatelitově stabilní (MSS). Na dalším následném semináři NCI bylo uznáno, že citlivost a specifičnost původního panelu Bethesda může být omezená v důsledku zahrnutí dinukleotidových repetic, které jsou pro identifikaci nádorů s nedostatkem MMR méně citlivé a specifické než mononukleotidové repetice. Bylo navrženo, že panel kvazimonomorfních mononukleotidových repetic může být dostatečně citlivý a specifický pro detekci nádorů s vysokým výskytem MSI a může odstranit potřebu normální shodné DNA pro testované nádory (1-8).

MSI Analysis System (kit pouze pro výzkumné účely, verze 1.2, Promega Corporation).

MSI Analysis System je multiplexní, fluorescenční test založený na PCR pro detekci mikrosatelitní nestability. Systém MSI Analysis System obsahuje fluorescenčně značené primery pro koamplifikaci pěti kvazimonomorfních markerů mononukleotidových repetic (BAT-25, BAT-26, NR-21, NR-24 a MONO-27). Produkty PCR se separují kapilární elektroforézou (CE) pomocí genetického analyzátoru Applied Biosystems 3500Dx. Mikrosatelitová nestabilita na 2 nebo více mononukleotidových lokusech je interpretována jako MSI-high; mikrosatelitová nestabilita na jednom mononukleotidovém lokusu nebo žádná nestabilita na žádném z testovaných lokusů je interpretována jako mikrosatelitová stabilita (MSS). Vzorky s vysokým MSI obvykle vykazují nestabilitu ve všech lokusech s průměrným poklesem velikosti produktu o 5 až 9 bází. Přítomnost MSI je detekována s analytickou specifičností nejméně 99 % a detekčním limitem nejméně 5 %.

Důležitým konstrukčním prvkem systému analýzy MSI je rozestup mezi pěti různými lokusy, který obecně přesahuje typický počet posunutých bází (průměrně 5 až 9 bází) při přítomnosti MSI. Nejdelší velikost amplikonu PCR je 154 párů bází, což je výhodné pro analýzu tkáně fixované formalínem a zalité do parafínu (FFPE).

Tento test je standardem pro rutinní testování MSI s vysokou propustností, zejména pokud jsou na stejném vzorku DNA požadovány další navazující molekulární testy.

Požadavky na vzorky

Přijatelné vzorky pro test jsou vzorky tkáně kolorektálního karcinomu fixované formalínem a vložené do parafínu s dobou fixace 6-48 hodin.

Objem

Preferuje se 1 reprezentativní parafínový blok. Alternativně je u resekčních vzorků požadováno minimálně 5 nenabarvených tkáňových řezů (tloušťka 5 µm).

Pokyny pro skladování a přepravu

Skladujte a přepravujte vzorky při pokojové teplotě.

Omezení

Nedostatečný obsah nádoru nemusí umožnit detekci nestability MSI: je požadováno 10 % nádorových buněk. Obsah nádoru se hodnotí před analýzou a provádí se makrodisekce. Jiná fixační činidla než formalín nebo prodloužená doba fixace mohou vést k nedostatečným výsledkům.

Speciální požadavky

Žádné.

Doba dodání

Pět až 7 pracovních dnů pro preparáty, resp. parafinové bloky.

2. IdyllaTM MSI Assay (CE-IVD) – čeká se na akreditaci

Test IdyllaTM MSI Assay (RUO) provádí detekci mikrosatelitní nestability přímo z formalínem fixovaných, do parafínu zalitých (FFPE) řezů lidské nádorové tkáně s využitím reakce PCR a následné analýzy křivky tání s vysokým rozlišením na přístroji IdyllaTM.

Test provádí detekci mutací v 7 monomorfních homopolymerních lokusech pro identifikaci lidských nádorů s mikrosatelitní nestabilitou (ACVR2A, BTBD7, DIDO1, MRE11, RYR3, SEC31A a SULF2). Tyto biomarkery jsou nádorově specifické, vykazují vysokou frekvenci u kolorektálního karcinomu a karcinomu endometria a jsou stabilní u různých etnik. Kromě toho tyto nádorově specifické biomarkery nevyžadují analýzu párových vzorků normální tkáně.

Stav MSI pro vzorek se určuje s konečnou výzvou pro všech 7 biomarkerů. Mikrosatelitová nestabilita na 2 nebo více mononukleotidových lokusech je interpretována jako MSI-high; mikrosatelitová nestabilita na jednom mononukleotidovém lokusu nebo žádná nestabilita na žádném z testovaných lokusů je interpretována jako mikrosatelitová stabilita (MSS).

Tento test umožňuje nízkokapacitní testování MSI a je ideální pro reflexní nebo záchranné testování k rychlému získání nebo potvrzení přesného výsledku MSI.

Požadavky na vzorky

Přijatelné vzorky pro test jsou vzorky tkáně kolorektálního karcinomu fixované ve formalínu a vložené do parafínu s dobou fixace 6-48 hodin.

Objem

Preferuje se 1 reprezentativní parafinový blok. Alternativně jsou u resekčních vzorků požadovány minimálně 2 nenabarvené tkáňové řezy (tloušťka 5 µm; 50-600 mm²).

Pokyny pro skladování a přepravu

Skladujte a přepravujte vzorky při pokojové teplotě.

Omezení

Nedostatečný obsah nádoru nemusí umožnit detekci nestability MSI: je požadováno 20 % nádorových buněk. Obsah nádoru se hodnotí před analýzou a provádí se makrodisekce. Jiná fixační činidla než formalín nebo prodloužená doba fixace mohou vést k nedostatečným výsledkům.

Speciální požadavky

Žádné.

Doba dodání

Tři až 5 pracovních dnů pro sklíčka, resp. parafinové bloky.

1. Umar A, Boland CR, Terdiman JP et al. Revised Bethesda Guidelines for Hereditary Nonpolyposis Colorectal cancer (Lynch Syndrome) and Microsatellite Instability. Journal of the National Cancer Institute 2004;96(4):261-268.
2. De la Chapelle A, Hampel H. Clinical Relevance of Microsatellite Instability in Colorectal Cancer. Journal of Clinical Oncology 2010;28(20):3380-3387.
3. Bacher JW, Flanagan LA, Smalley RL et al. Development of a fluorescent multiplex assay for detection of MSI-High tumors. Disease Markers 2004; 20:237-250.
4. Murphy KM, Zhang S, Geiger T et al. Comparison of the Microsatellite Instability Analysis System and the Bethesda Panel for the Determination of Microsatellite Instability in Colorectal Cancers. Journal of Molecular Diagnostics 2006;8(3):305-311.
5. Anderson S, Bloom KJ, Vallera DU et al. Multisite Analytic Performance Studies of a Real-Time Polymerase Chain Reaction Assay for the Detection of BRAF V600E Mutations in Formalin-Fixed Paraffin-Embedded Tissue Specimens of Malignant Melanoma. Arch pathol lab Med 2012;136(11):1385-1391.
6. Buhard O, Suraweera N, Lectard A et al. Kvazimonomorfní mononukleotidové repetice pro analýzu mikrosatelitní nestability na vysoké úrovni. Disease Markers 2004;20:251-257.
7. Patil DT, Bronner MP, Portier BP et al. A five-marker panel in a multiplex PCR accurately detects microsatellite instability-high colorectal tumors without control DNA. Diagn Mol Pathol 2012 Sep;21(3):127-33.
8. Berg KD, Glaser CL, Thompson RE et al. Detection of microsatellite instability by fluorescence mulitplex polymerase chain reaction. J Mol Diagn 2000, 2:20-28.
9. De Craene et al. Detekce mikrosatelitní nestability (MSI) ve vzorcích kolorektálního karcinomu pomocí nové sady vysoce citlivých markerů pomocí prototypu IdyllaTM MSI Test. Journal of Clinical Oncology 2018; 36:15.

Aktualizováno 23. května 2019

.