Clostridium botulinum – Botulismus (Klinické formy). Testy pro diagnostiku botulismu. Detekce toxinu u pacientů, potravin, krmiv, kalů nebo vodních sedimentů; vodní ptactvo, jiné vzorky. Doporučené testy: detekce toxinu, kultivace C. botulinum, typizace botulotoxinu; molekulární diagnostika (PCR).

Charakteristika Clostridium botulinum a botulotoxinu/ů

Clostridium botulinum je přísně anaerobní grampozitivní bacil, rod Clostridium, čeleď Clostridiaceae, tvořící spory, který produkuje neurotoxický toxin. Tato bakterie se obvykle vyskytuje v půdě a neupravené sladké vodě a sedimentech (oceány, jezera), s celosvětovým rozšířením. Za určitých okolností může tento organismus kontaminovat potraviny a růst v nich a produkovat svůj toxin/y. Botulismus, závažná forma otravy potravinami, vzniká po požití potravin obsahujících tento toxin. Ačkoli je toto onemocnění vzácné, jejich úmrtnost je vysoká. Při zjišťování typu toxinu mezi 1036 případy zjištěnými v USA v letech 1899-1990 bylo 384 případů způsobeno toxinem A, 106 toxinem B, 105 toxinem E a 3 toxinem F. Někdy se mohou vyskytnout případy způsobené dvěma toxiny, například A a B.

Všechny formy lidského nebo zvířecího botulismu, jsou způsobeny vstřebáním botulotoxinu, který vzniká při množení bakterie Clostridium botulinum. Toxin má velmi vysokou toxicitu (neurotoxicitu), takže působí při extrémně nízkých hladinách, je termolabilní, zatímco spory bakterie jsou tepelně odolné a přežívají v potravinách zahřátých na teplotu vyšší než 100 ºC, například v konzervách tepelně upravených. Kromě toho mohou některé kmeny C. botulinum, C. butyricum, C. baratii a C. argentinense produkovat botulinové neurotoxiny.

Existuje sedm typů toxinů (A – G) rozlišitelných neutralizačními testy, užitečných pro klinickou a epidemiologickou praxi. Typy A, B, E a F jsou hlavními příčinami botulismu u lidí, zatímco typy C a D se vyskytují v případech botulismu u zvířat, přičemž nejvíce postiženi jsou volně žijící ptáci a drůbež, skot, koně a některé druhy ryb. Typy A a B se nejčastěji vyskytují u lidí a souvisejí především s kontaminací doma připravovaných zeleninových konzerv, ale v Evropě byly tyto typy zjištěny i v souvislosti s masnými výrobky. Typ E (ryby) se vyskytuje ve vodním prostředí a koreluje s případy botulismu typu E týkajícími se kontaminovaných ryb nebo korýšů a jeho výskyt se zvyšuje. Typ F je výjimečný. Typ C se dělí na C1 (neurotoxinový) a C2 (není neurotoxinový, ovlivňuje vaskulární permeabilitu a je enterotoxigenní). Typ G je produkován C. argentiniense (izolován z půdy v Argentině, ze séra zemřelých pacientů, i když není jasné zapojení).

Toxiny jsou syntetizovány během růstu bakterie jako neaktivní protein (150 kDa), který se z bakterie uvolňuje při lýze. Pro aktivaci by se měl vytvořený toxin rozložit na dva polypeptidové řetězce (50 a 100 kDa).

C. botulinum, lze rozlišit do skupin podle jejich kultivačních vlastností, biochemických a fyziologických. Všechny kultury typu A a některé kultury typu B a F jsou proteolytické. Kultury C. botulinum produkující toxiny typu C a D nejsou proteolytické, pokud jsou kultivovány v médiu se sraženým vaječným bílkem nebo masem. Všechny typy E a některé z typů B a F jsou neproteolytické, ale mají vlastnosti metabolismu sacharidů, které se liší od neproteolytických skupin typů C a D. Kmeny typu G nemají Pro účinnou a uspokojivou charakterizaci byla dostatečně podrobně studována.

Optimální teplota pro růst a produkci toxinů je pro proteolytické kmeny asi 35 ºC; pro neproteolytické kmeny 26-28 ºC. Neproteolytické kmeny typů B, E a F mohou produkovat toxin při chladírenských teplotách (3-4ºC). Toxiny neproteolytických kmenů vykazují maximální toxicitu až po aktivaci toxinu trypsinem. Toxiny proteolytických kmenů jsou obvykle produkovány v jeho aktivované formě.

Klinické formy botulismu

Existují čtyři klinické formy lidského botulismu:

• Otrava potravinami (foodborne botulism), způsobená požitím potravin kontaminovaných Clostridium botulinum, ve kterých se tvoří toxin.

• Botulismus v ráně, vzniká infekcí rány bakterií Clostridium botulinum a vývojem toxinu in vivo po růstu bakterie v ráně.

• Botulismus kojenců, vzniká tvorbou toxinu v trávicím traktu malých dětí kolonizovaných bakterií Clostridium botulinum (nejčastější příčinou je požití kontaminovaného medu nebo kukuřičného sirupu) s následným vstřebáním toxinu. Tito pacienti mohou mít proti toxinu protilátky.

• Střevní botulismus dospělých, způsobený kolonizací trávicího traktu Clostridium botulinum u starších osob, po které následuje absorpce toxinu. Tito pacienti mohou mít proti toxinu protilátky.

U kterékoli z klinických forem lidského botulismu a stejně tak u zvířecího botulismu proniká toxin do krve z trávicího traktu při požití preformy s potravou nebo při produkci bakterií, která kolonizuje trávicí trakt (malé děti nebo dospělí), nebo ve výjimečných případech děti z infikované rány bakterií. Existují potraviny, u nichž je větší pravděpodobnost, že budou obsahovat botulotoxin, než u jiných. Potraviny s pH nižším než 4,5 jsou obtížněji příčinou botulismu, protože při tomto pH se C. botulinum nedokáže množit a produkovat toxin (to je případ ovocných šťáv, potravin naložených v octě apod.). Naopak potraviny s pH rovným nebo vyšším než 4,5 mohou způsobit botulismus, protože v nich je možné pomnožení a produkce toxinu (to je případ masa, ryb, zeleniny, hotových pokrmů atd.), na všechny tyto potraviny působí bez přístupu kyslíku, stejně jako u konzervovaných nebo vakuově balených potravin, a mají pH vyšší než 4,6. Příkladem jsou nebezpečné potraviny: uzená šunka, uzené, konzervované ryby nebo zelenina (podrobené tepelné úpravě nedostatečné k usmrcení spor) atd. Konzervy kontaminované C. botulinum jsou obvykle prohnuté, ačkoli u typu E k tomu nedochází.

Vstřebaný toxin se nevratně váže na nervosvalové spoje motorických neuronů, zabraňuje uvolňování acetylcholinu a způsobuje ochablé ochrnutí nebo svalovou slabost.

Klinicky je charakterizována akutní ochablou paralýzou, která obvykle začíná oboustranným postižením lebečních nervů, postihuje svaly obličeje, hlavy a hltanu a poté sestupuje symetricky k postižení svalů hrudníku a končetin. Smrt, pokud nastane, je způsobena selháním dýchání ochrnutím jazyka a hltanových svalů, které uzavírají horní cesty dýchací, nebo ochrnutím bránice a mezižeberních svalů. Z tohoto důvodu by pacienti měli dostat botulotoxin a potřebnou respirační intenzivní péči.

Diagnostické testy na botulismus

Detekce botulotoxinu ve vzorcích nebo potravinách bez kultivace (viz doporučený vzorek v části “Testy nabízené IVAMI a požadované vzorky”).

Toto vyšetření se doporučuje u pacienta s klinickými známkami botulismu.

Detekci botulotoxinu lze provést v tekutině, jako je sérum získané z krve. Lze jej také zjistit ze zbytků požitých potravin, které způsobily případ nebo ohnisko botulismu. K provedení testu pomocí zbytků potravin je nutné získat z nich filtrát extraktu. V případech kojeneckého botulismu nebo střevního botulismu lze zjistit přítomnost toxinu ve stolici dětí nebo pacientů, ale za vhodnější považujte provedení předběžné kultivace stolice (viz níže ). Detekce toxinu botulismu v některém z případů se provádí inokulací u mikrobů, u nichž se vyvinou paralytické příznaky s následnou smrtí, pokud jsou inokulovány botulotoxinem. K potvrzení, že myši uhynuly na vpravený botulotoxin, je třeba provést neutralizační test, který potvrdí, že v nich byl botulotoxin přítomen, a určí typ přítomného botulotoxinu. Tento neutralizační test se provádí tváří v tvář inokulovanému produktu (lidskému nebo zvířecímu séru, extraktu z požité potravy, …) specifickým antisérům každého typu toxinu.

Před krokem neutralizačního testu je nutné vypočítat minimální smrtelnou dávku (MLD). Takto vypočítáme maximální (nejvyšší) ředění, které způsobí smrt infikovaných zvířat, a naočkovaný objem způsobil smrt zvířat obsahuje letální minimální dávku (LMD).

Pro identifikaci typu toxinu, jakmile je známa “minimální letální dávka”, je tato konfrontována s různými antisérami proti botulinovému typu toxinu. Tyto směsi se ve stejném objemu naočkují pokusným myším a ty, které přežily, byly naočkovány směsí “minimální letální dávky” plus antiséra k typu, který byl schopen neutralizovat.

Detekce toxinu ve vzorcích/výrobcích po předkultivaci (viz Doporučené vzorky po v testu nabízeném IVAMI a požadované vzorky).

Pokud lze ve vzorku nalézt bakterii Clostridium botulinum, která produkuje toxin, doporučuje se před kultivací vyšetřit toxin po vykultivování vzorku. Jedná se o výkaly pacienta s kojeneckým botulismem nebo střevním botulismem, zbytky snědené potraviny, ve které se rozmnožila bakterie (např. konzerva prerserve), podezřelá potravina, která by mohla obsahovat tuto bakterii (např. vyboulená konzerva), kontrolovaná potravina k vyloučení přítomnosti této bakterie (např, uzeniny, šunky, konzervy), nebo jiné vzorky, např. sladkovodní kaly nebo vodní mořské sedimenty atd. z oblastí, kde byl pozorován úhyn vodního ptactva.

Při kultivaci v laboratoři ve vhodném kultivačním médiu vzniká toxin, pokud je bakterie přítomna, a získání kultivačního filtrátu může být užitečné pro zkoumání její přítomnosti, naočkování filtrátu myším. Pokud jsou inokulované myši postiženy, naznačuje to pravděpodobnou přítomnost Clostridium botulinum ve vzorku o růstu v kultuře. Myši však mohly uhynout z jiné příčiny, proto je nutné před vydáním zprávy zkontrolovat, zda skutečně uhynuly z důvodu, že byly naočkovány botulotoxinem.

Pro potvrzení přítomnosti botulotoxinu v kultuře lze provést neutralizační testy s použitím specifických antisér pro každý typ botulotoxinu (neutralizační test) nebo detekci přítomnosti genů Clostridium botulinum a jeho typu v kultivačním médiu (molekulární detekce pomocí PCR).

Neutralizační test se provádí konfrontací inokulovaného vzorku (kultivačního filtrátu) se specifickými antiséry pro každý typ toxinu.

Před krokem neutralizačního testu je nutné vypočítat minimální letální dávku (MLD). Tak se vypočítá (nejvyšší) maximální ředění, které způsobí smrt inokulovaných zvířat, a inokulovaný objem způsobil smrt zvířat obsahuje minimální letální dávku.

Pro identifikaci typu toxinu, jakmile je známa “minimální letální dávka”, se provede konfrontace minimální letální dávky s různými typy anti-botulínových sér. Tyto směsi se ve stejném objemu naočkují pokusným myším a těm, které přežijí, se naočkuje směs “minimální smrtelné dávky” plus antisérum k typu, který byl schopen neutralizovat.

Molekulární detekce pomocí PCR umožňuje vyhnout se času potřebnému pro výpočet minimální smrtelné dávky (MLD) a neutralizační test.

Detekce protilátek proti botulotoxinu (viz doporučený vzorek po v části Testy nabízené IVAMI a požadované vzorky)

• Pacienti léčení zředěným botulotoxinem, např. ti, kteří dostávají botox pro estetické nebo lékařské ošetření (např. gr. bolesti způsobené neuralgií trigeminu obličeje), ke zjištění přítomnosti protilátek, které brání jeho účinku.

• Pacienti s podezřením na dětský botulismus nebo botulismus dospělých, u kterých se nepodařilo nalézt bakterii Clostridium botulinum toxin ve stolici nebo séru.

• Očkovaní jedinci, kteří mají zájem zkontrolovat stav ochrany.

Botulotoxin Clostridium botulinum ve velmi vysokých ředěních byl použit lokálním podáním k léčbě spastických procesů. Ukázalo se, že tyto procesy jsou užitečným prostředkem. Tyto procesy jsou obvykle chronické spastické, čímž vyžadují, aby byl toxin podáván trvale. Proto může během léčby vzniknout rezistence v důsledku postupné imunizace pacienta v průběhu léčby, v takovém případě by byl účinek omezen. K odhalení této imunizace je nutné přesně a citlivě měřit existenci protilátek proti botulotoxinu A a/nebo B.

Přijatou referenční metodou pro detekci a kvantifikaci protilátek proti botulotoxinu je neutralizační test u myší (Mouse Neutralization Assay), při kterém se ředění botulotoxinu, kvantifikované letální dávkou 50 % pro myš (DL50), smíchá s různými ředěními séra/plazmy o bázi 2 nebo 4 a po inkubaci se každé z nich intraperitoneálně naočkuje skupinám myší. Nejvyšší ředění testovacího séra, které snižuje toxicitu, odpovídá titru protilátek proti příslušnému botulotoxinu. Toto ředění v porovnání s mezinárodním standardem umožňuje získat výsledky v mezinárodních jednotkách (IU/ml) (1 IU je definována jako množství protilátky, které neutralizuje 10 000 LD50 toxinů A nebo B nebo 1000 LD50 typu E). Množství toxinu použité v testech je takové, které je neutralizováno 0,02; 0,005 a 0,0125 IU/ml antitoxinu pro typy A, B a E (Hatheway et al. 1984). Séra, která chrání myši v titru 1 : 4, jsou uváděna jako <0,08 IU/ml pro typ A, nebo <0,02 IU/ml pro typ B. Test je pracný, drahý a dlouho trvající provádění, proto byly hledány alternativy enmzimoinmunoanalýzy založené na metodách (ELISA) s použitím mikrotitračních destiček potažených botulotoxinem. Hodnoty získané metodou ELISA však někdy plně nekorelují s neutralizačním testem na myších.

Před krokem neutralizačního testu je nutné vypočítat minimální letální dávku (DLM) toxinu. Výpočet minimální letální dávky se provádí tak, že se filtrát z kultury naředí základem 10, polovina se zředí fyziologickým roztokem, aby se získalo stejné ředění jako toxin smíchaný se sérem nebo plazmou pacienta, a každá směs ředění se naočkuje laboratorním myším. Takto se vypočítá (nejvyšší) maximální ředění, které způsobí smrt infikovaných zvířat. Očkovaný objem, který způsobil smrt zvířat, obsahuje minimální smrtelnou dávku (MLD).

Pokud je známa minimální letální dávka, vypočtěte minimální neletální dávku (dmnm) odpovídající minimálnímu množství toxinu v přítomnosti konstantního množství antitoxinu, které nezabije naočkované myši. Toto množství toxinu je neutralizováno odpovídajícími jednotkami antiotoxinu anti-A nebo antitoxinu anti-B. Minimální neletální dávka se nazývá proto, že je to minimální množství toxinu, které nezpůsobí smrt myší v přítomnosti antitoxinu.

Testy nabízené IVAMI a požadované vzorky:

• Detekce botulotoxinu u lidských případů nebo ohnisek potravinového botulismu:

• • Pacientské sérum (nejméně 5 ml) naposledy získané pro očkování myší a typizace toxinu, pokud byly myši zasaženy.

• • V případech kojeneckého botulismu nebo střevního botulismu lze botulotoxin zjistit ve stolici dětí/pacientů, ale doporučujeme spíše provést předběžnou kultivaci stolice.

• Detekce toxinu a/nebo Clostridium botulinum v požitých potravinách podezřelých z vyvolání botulismu nebo v potravinách podléhajících kontrole

• • Vzorek podezřelé nebo kontrolované potraviny (doporučujeme alespoň cca 100 g) pro přípravu vzorku určeného k očkování myší a zjištění přítomnosti předem připraveného toxinu v potravině, jakož i pro provedení kultivace za účelem získání filtrátu pro očkování myší a zjištění, zda se ve vzorku vyskytovala bakterie produkující toxin; Pokud máte pouze zbytky potravin, doporučuje se zaslat celé dostupné množství.

• Detekce Clostridium botulinum v případech kojeneckého botulismu nebo střevního botulismu

• • Výkaly v případech kojeneckého botulismu nebo střevního botulismu v důsledku střevní kolonizace (10 g), pro kultivaci a detekci toxinu ve filtrátu kultury při očkování myší.

• Detekce Clostridium botulinum v případech botulismu v ráně

• • Exsudát z rány v případech podezření na botulismus v ráně, pro kultivaci a detekci toxinu ve filtrátu kultury očkováním myší. Pokud je vzorek transportován aerobně, Clostridium botulinum mohlo být inaktivováno, bylo by vhodnější provést molekulární test na přítomnost genů Clostridium botulinum a v případě pozitivity určit typ botulotoxinu detekcí genů odpovídajících jednotlivým typům toxinů.

• Detekce Clostridium botulinum ve vzorcích sladkovodních kalů nebo vodních mořských sedimentů a jiných produktů nezahrnutých v předchozích oddílech

• • 100 g vzorků přibližně pro provedení kultivace na růst Clostridium botulinum a získání kultivačního filtrátu pro očkování myší.

• Detekce protilátek proti botulotoxinu v séru nebo plazmě

• • Sérum nebo plazma (přibližně 10 ml), pro testování neutralizačních protilátek v séru nebo plazmě proti různým toxinům dostupným v laboratoři. Tento test má význam pro stanovení přítomnosti specifických protilátek u osob léčených botulotoxinem, u pacientů s podezřením na dětský botulismus, u dospělých, u kterých se nepodařilo nalézt bakterie ve stolici, nebo u očkovaných osob pro kontrolu stavu ochrany. V případech osob léčených botulotoxinem Musí být uveden typ toxinu, který byl pacientovi podán.

Čas pro hlášení výsledků (TAT)

• Přesné časy nemůžeme uvést. Pokud se testuje pouze na detekci toxinu očkováním myší a výsledek je negativní, hlášení výsledků by bylo maximálně za týden. Pokud by testování zahrnovalo kultivaci vzorku a poté detekci toxinu vyrobeného inokulací filtrátu myší kultury, doba by byla dva týdny. Pokud by některý z těchto testů očkování myší, extraktu ze vzorku nebo kultivačního filtrátu byl pozitivní, měl by být proveden neutralizační test na myších, aby se potvrdilo, že se jedná o botulotoxin a identifikoval se jeho typ pomocí neutralizačních testů, doba dokončení je 15 dní.

• Reálné testy PCR zpráva jsou za 3 nebo 4 dny.

Formulář s charakteristikami výrobku a vybranou zkouškou/zkouškami

• Pokud žádáte o provedení zkoušek s výrobkem, musíte předložit dopis, ve kterém jsou uvedeny charakteristiky výrobku a vybrané zkoušky, které mají být provedeny se zaslaným vzorkem.

Objem vzorku

• Vždy v závislosti na typu zkoušek nabízených IVAMI.

Podmínky skladování a přepravy vzorků

• Zasílají se za podmínek, za kterých se vzorek obvykle nachází, chráněný pro přepravu. V případě vzorků, které se mohou rozkládat, protože jsou kontaminovány bakteriemi nebo vlastními organickými látkami (rychle se kazící potraviny, zvířecí nebo lidská séra, výkaly, kaly, … …), musí být vzorky skladovány a zasílány zmrazené nebo alespoň za podmínek, které zajistí chlazení během přepravy (s nádobou na vzorek uvnitř krabice -expandovaný polystyren- (bílý korek) se zmrazenými chladicími obaly. Poznámka: tento organismus sám o sobě nepředstavuje riziko kontaminace biologickou expozicí.

Náklady na testování

• Detekce toxinů u lidských případů / ohnisek potravinového botulismu

• • Očkování myší sérem pacienta nebo extraktem z požité potraviny ……………………………….. ……………………………………………………………………………………………………………Konzultace [email protected]

• • Pokud je pozitivní, potvrzující test na neutralizaci a identifikaci typu toxinu …………….. …………………………………………………………………………………………………………..Konzultace [email protected] .

• Detekce toxinu a/nebo Clostridium botulinum v potravinách požitých, podezřelých z vyvolání botulismu nebo v potravinách podléhajících kontrole

• Detekce Clostridium botulinum v případech kojeneckého botulismu nebo střevního botulismu

• • Volitelné: Očkovací test na myších se sérem nebo extraktem z požité potraviny ………………………………….. ……………………………………………………………………………………………………………Konzultace [email protected]
  • Doporučuje se. Kultivační test, následovaný inokulací myší kulturním filtrátem ………………………….. …………………………………………………………………………………………………………..Konzultace [email protected]
  • Je-li pozitivní, konfirmační test na neutralizaci a identifikaci typu toxinu …………………….. …………………………………………………………………………………………………………..Konzultace [email protected]

• Detekce Clostridium botulinum v případech botulismu v ráně

• • Kultivační test, následuje očkování myší kultivačním filtrátem ……………………. Konzultace [email protected]
  • Pokud je pozitivní, konfirmační test na neutralizaci a identifikaci typu toxinu …………….. …………………………………………………………………………………………………………..Konzultujte [email protected]

• Detekce Clostridium botulinum ve vzorcích kalů / sladké vody nebo mořských sedimentů a jiných produktů, které nejsou zahrnuty v předchozích oddílech

• • Kultivační test, po kterém následuje očkování myší filtrátem kultury ……………………. Konzultace [email protected]
  • Je-li pozitivní, konfirmační test na neutralizaci a určení typu toxinu ………………. …………………………………………………………………………………………………………..Konzultace [email protected]

• Detekce anti-botulotoxinu v séru nebo plazmě (týká se typu protilátky, proto musí být uveden typ toxinu podaného jedinci) ……………………………………………….. Konzultujte [email protected]