Abstract

Byl hodnocen vliv zinku, hořčíku a vápníku v semenné plazmě na dobu do otěhotnění (TTP) u zdravých párů, na konvenční parametry spermatu a na parametry počítačem asistované analýzy spermatu (CASA). Lokalizace chelatovatelných iontů zinku v seminální plazmě a spermiích byla hodnocena pomocí autometalografie (AMG). Byly hodnoceny rozdíly v lokalizaci chelatovatelného zinku ve vzorcích s vysokým a nízkým obsahem celkového zinku. Vzorky spermatu od 25 párů s krátkým TTP a 25 párů s dlouhým TTP byly podrobeny konvenční analýze spermatu, CASA, měření zinku a hořčíku pomocí hmotnostní spektrometrie s indukčně vázaným plazmatem a vápníku pomocí plamenové atomové absorpční spektrometrie. Kationty byly silně vzájemně korelovány, ale nebyla zjištěna žádná korelace s TTP nebo konvenčními parametry spermatu. Vzorky spermatu s vysokou koncentrací zinku vykazovaly statisticky významně horší motilitu hodnocenou pomocí parametrů CASA rychlost přímky a linearita než vzorky s nízkým obsahem zinku. Koncentrace vápníku také vykazovala statisticky významné rozdíly u stejných parametrů, ale tento vliv byl odstraněn zadáním koncentrace zinku do vícenásobného regresního modelu. Vzorky spermatu s vysokým obsahem celkového zinku vykazovaly silnější zabarvení semenné plazmy při AMG. Předpokládá se, že vysoká koncentrace zinku v semeni má tlumivý účinek na progresivní pohyblivost spermií (´kvalita pohybu´), ale ne na procento pohyblivých spermií (´kvantita pohybu´).

Úvod

Celkový obsah zinku ve spermatu savců je vysoký a bylo zjištěno, že zinek má zásadní význam pro spermatogenezi. Nedostatek zinku je spojen s hypogonadismem a nedostatečným vývojem sekundárních pohlavních znaků u lidí (Prasad, 1991) a může způsobit atrofii semenných kanálků u potkanů, a tím selhání spermatogeneze (Millar et al., 1958; Underwood, 1977; Endre et al., 1990). Bylo zjištěno, že vysoké koncentrace zinku snižují příjem kyslíku ve spermatické buňce (Huacuja et al., 1973; Foresta et al., 1990) a albuminem indukovanou akrozomovou reakci (Foresta et al., 1990). Připojení/odpojení hlavičky a jaderné kondenzace/dekondenzace chromatinu je rovněž ovlivněno semenným zinkem (Kvist, 1980; Bjorndahl a Kvist, 1982). O vlivu semenného zinku na pohyblivost spermií existují rozporuplné zprávy (Stankovic a Mikac-Devic, 1976; Danscher a kol., 1978; Caldamone a kol., 1979; Lewis-Jones a kol., 1996). Bylo prokázáno, že chelatace zinečnatých iontů ovlivňuje pohyblivost spermií (Saito et al., 1967; Danscher a Rebbe, 1974), a bylo navrženo, že měřítkem účinku zinku na funkci spermií by měl být spíše biologicky dostupný zinek vázaný na vezikulární vysokomolekulární proteiny než celkový semenný zinek (Bjorndahl et al., 1991; Carpino et al., 1998).

Tato studie se zaměřuje především na zinek. Byla hodnocena souvislost semenného zinku a do jisté míry i hořčíku a vápníku s dobou do otěhotnění (TTP) u zdravých párů. Dále byla hodnocena korelace těchto dvojmocných kationtů s konvenčními parametry spermatu a parametry počítačem asistované analýzy spermatu (CASA).

Autometalografie (AMGZn) je histochemická metoda pro detekci zinečnatých iontů a volně vázaných zinečnatých iontů (chelatovatelný zinek) ve tkáni. Byly zkoumány rozdíly v lokalizaci zinečnatých iontů na světelně mikroskopické a elektronově mikroskopické úrovni ve spermiích a semenné plazmě mužů s vysokým a nízkým obsahem celkového zinku.

Materiál a metody

Studovaný soubor

Celkem 430 párů bylo rekrutováno z 52 255 členů čtyř odborových organizací. Od 430 párů byly získány vzorky spermatu, pohyblivost byla hodnocena manuálně a pomocí CASA (viz dále) a vzorky byly uloženy ve zmrazeném stavu (-20 °C) až do další analýzy. Páry bez dřívějších reprodukčních zkušeností byly zařazeny, když přerušily antikoncepci, a byly sledovány po dobu minimálně šesti kompletních menstruačních cyklů nebo do rozpoznání těhotenství . Ze 430 párů bylo pro tuto studii vybráno 50 párů, které otěhotněly: 25 párů s nejkratším TTP (S-TTP, medián 1 měsíc, rozmezí 1-2 měsíce) a 25 párů s nejdelším TTP (L-TTP, medián 10 měsíců, rozmezí 7-28 měsíců). Vzorky spermatu od těchto 50 párů byly podrobeny níže uvedeným analýzám.

Konvenční charakteristiky spermatu

Vzorky spermatu byly získány masturbací do 50 ml sterilních polystyrenových nádobek po doporučené 3denní abstinenci. Po zkapalnění byly vzorky analyzovány při pokojové teplotě podle kritérií Světové zdravotnické organizace (1992).

Objem byl měřen v 10 ml odměrné skleněné zkumavce Falcon (přesnost 0,1 ml). Manuální hodnocení pohyblivosti spermií bylo provedeno v počítací komůrce Makler (Sefi Medical Instruments, Haifa, Izrael). Každá nalezená spermie byla hodnocena takto: a: rychlá progresivní motilita, b: pomalá nebo pomalá progresivní motilita, c: neprogresivní motilita, d: imobilita. Bylo provedeno nejméně 2×100 hodnocení. Pokud rozdíl mezi dvěma po sobě jdoucími počty přesáhl 10 %, byly provedeny dva nové počty. Procento pohyblivých spermií bylo definováno jako skupiny `a + b + c’. Koncentrace byla měřena v Maklerově počítací komůrce a morfologie byla klasifikována podle Tygerbergových ´přísných´ kritérií popsaných Krugerem et al. (1986) na na vzduchu sušených nátěrech fixovaných v etanolu a éteru, barvených Papanicolaouovou technikou (World Health Organization, 1992). Hodnocení morfologie prováděl jeden vyškolený laborant. Životaschopnost spermií byla stanovena na nátěrech obarvených eosinem a negrosinem.

Počítačová analýza spermatu

Materiál pro CASA byl získán následujícím způsobem: 4,5 μl čerstvých, dobře promíchaných spermií bylo pipetou přeneseno do počítací komůrky Makler s hloubkou 10 μm. Vzorek byl umístěn do mikroskopu Olympus BH-2 s fázovým kontrastem (Olympus Denmark A/S, Glostrup, Dánsko) s vyhřívací destičkou (37 °C) při zvětšení ×200. Videokamera Sony DXC-107 (Sony Corp., Tokio, Japonsko) přenášela snímky na barevný videomonitor Sony PVM-1440QM (Sony Corp., Tokio, Japonsko). Záznamy snímků byly pořízeny na videokazetový magnetofon JVC HR-D560EG/E (JVC Victor Company of Japan, Tokio, Japonsko). Záznamy byly později analyzovány na přístroji Hobson Sperm Tracker (Hobson Tracking Systems Ltd, Sheffield, Velká Británie) při frekvenci snímání 25 Hz, době sledování 2 s (celkem 50 snímků), zorném poli 300 × 300 μm (což umožňuje detekovat všechny hodnoty přímočaré rychlosti do 150 μm/s). Na jeden vzorek bylo analyzováno 100 spermií.

Z analýz byly odvozeny následující parametry: křivočará rychlost (VCL), přímočará rychlost (VSL), linearita (LIN), průměrná dráhová rychlost (VAP) a amplituda laterálního posunu hlavičky (ALH).

Stanovení zinku, hořčíku a vápníku ve spermatu

Seminální zinek, hořčík a vápník byly měřeny u všech 50 vzorků. Koncentrace zinku a hořčíku ve spermatu byly stanoveny pomocí hmotnostní spektrometrie s indukčně vázaným plazmatem (ICP-MS). Přístroj byl PQ2+ od firmy Fisons Elemental (Winsford, Cheshire, Spojené království). Alikvot 20 μl byl 100krát zředěn roztokem obsahujícím 5 g/l 25% amoniaku (ARISTAR; Merck, Poole, UK), 0,5 g/l EDTA (Janssen Chimica, Geel, Belgie) a 0,5 g/l Tritonu X-100 (Sigma, St Louis, MO, USA) v 18 MW vodě Millipore. Jako vnitřní standard bylo přidáno skandium (AccuStandard, New Haven, CT, USA) na konečnou koncentraci 100 μg/l. Všechny vzorky byly připraveny ve dvou opakováních. Kalibrace byla provedena pomocí slepých vzorků, ke kterým byl přidán zinek a hořčík (AccuStandard) na konečné koncentrace 1, 2 a 3 mg/l, což odpovídá koncentracím 100, 200 a 300 mg/l v původních vzorcích spermatu. Tato analýza byla provedena v režimu přeskakování píků s měřením při 24Mg, 66Zn a 45Sc.

Stanovení vápníku bylo provedeno ve stejných preparátech pomocí plamenové atomové absorpční spektrometrie (FAAS). Přístrojem byl Perkin-Elmer 306 (Norwalk, CT, USA). Kalibrace byla provedena pro koncentrace odpovídající 100, 200 a 400 mg/l v původních vzorcích spermatu. Vzorky s vysokými koncentracemi vápníku byly dále třikrát zředěny, aby se vešly do kalibrační křivky.

Meze detekce, vypočtené jako trojnásobek směrodatné odchylky pro 10 slepých vzorků připravených při stejné příležitosti jako vzorky, byly 1 mg/l pro zinek, 3 mg/l pro hořčík a 2 mg/l pro vápník (vyjádřeno jako koncentrace v neředěných vzorcích spermatu). Celkové variační koeficienty stanovení, vypočtené z výsledků duplicitních analýz, byly 18 % pro zinek, 32 % pro hořčík a 17 % pro vápník.

V deseti vzorcích byly rovněž připraveny preparáty pro stanovení zinku plamenovou atomovou absorpční spektrometrií (FAAS). Lineární regresní analýza výsledků ICP-MS versus FAAS poskytla sklon 0,79 (95% interval spolehlivosti: 0,58-1,00), intercepci 13 μg/l a r2 0,90. Na základě těchto výsledků bylo možné stanovit obsah zinku v krvi. Poněkud vyšší výsledky analýz ICP-MS tedy nebyly statisticky významné.

Autometalografické (AMG) vyvolání nátěrů spermatu pro světelnou mikroskopickou analýzu

Pět vzorků s vysokým (242-308 mg/l) a pět s nízkým (38-57 mg/l) obsahem zinku stanoveným pomocí ICP-MS bylo inkubováno v 0,5% sulfidu sodném (Bie & Berntsen) po dobu 30 minut za účelem vytvoření mřížek sulfidu zinečnatého. Roztěry roztoku ejakulátu/sulfidu byly provedeny na opláchnutých sklíčkách Farmer . Roztěry byly vysušeny na vzduchu, fixovány v 3% glutaraldehydu (Bie & Berntsen) po dobu 30 min a umístěny do 0,1 M fosfátového pufru na 3×2 min a jednou do destilované vody na 2 min.

Roztěry byly poté vyvolány AMG pro zesílení mřížek sulfidu zinečnatého stříbrem. Vývojka se skládala z 60 ml filtrovaného roztoku arabské gumy (1 kg rozpuštěný ve 2 l destilované vody; Bidinger A/S, Aarhus, Dánsko), 10 ml citronan sodného pufru a 0,85 g hydrochinonu (Merck, Darmstadt, Německo) rozpuštěného v 15 ml teplé destilované vody. Bezprostředně před použitím bylo přidáno 0,11 g mléčnanu stříbrného (Fluka, Buchs, Švýcarsko) v 15 ml destilované vody a roztok byl důkladně promíchán.

Vypláchnuté nádobky se spermatickými nátěry byly umístěny do vodní lázně o teplotě 26 °C a přeneseny do světlotěsného boxu. Do sklenic byla nalita nově připravená AMG vývojka a stěry byly vyvolávány 30 min v tmavém boxu.

Po vyvolání byly stěry opláchnuty v tekoucí deionizované vodě po dobu 10 min, umístěny do 5% thiosíranu sodného na 5 min, promyty tekoucí deionizovanou vodou po dobu 2 min, postfixovány 70% ethanolem po dobu 30 min a nakonec promyty tekoucí deionizovanou vodou po dobu 2 min. Protibarvení bylo provedeno 0,1% vodným roztokem toluidinové modři, pH 4,0 (1 g toluidinové modři v 1000 ml pufru: (614,5 ml 0,1 M monohydrátu kyseliny citronové a 385,5 ml 0,2 M dihydrátu hydrogenfosforečnanu sodného; Merck, Darmstadt, Německo). Stěry byly umístěny na 2 × 2 minuty do destilované vody, 3 × 3 minuty do 99% ethanolu, 3 × 3 minuty do xylolu a nakonec byly namontovány pomocí DEPEX (Merck, Darmstadt, Německo).

Příprava stěrů spermatu pro elektronmikroskopickou analýzu

Stěry vzorků spermatu byly připraveny, jak je popsáno výše, s tím rozdílem, že nebyly namontovány pomocí DEPEX. Po proceduře byl na 30 min přidán 0,5% tetroxid osmia a nátěry byly umístěny na 3×2 min do pufru a 1×2 min do destilované vody. Kontrastní nátěry s osmiem byly studovány ve světelném mikroskopu a oblasti zájmu pro další elektronmikroskopické analýzy byly označeny diamantovým nožem.

Vybrané nátěry byly dehydratovány v odstupňovaných roztocích ethanolu a vloženy do Eponu (Bie & Berntsen). Eponové bloky umístěné na předem označená zájmová místa byly ponechány při teplotě 60 °C po dobu 24 hodin a poté byly skleněné nátěry odlomeny. Byly vyříznuty polotenké (3 μm) řezy a umístěny na skleněná sklíčka. Po světelných mikroskopických analýzách byly vybrané řezy znovu uloženy do materiálu Epon a před vyšetřením v elektronovém mikroskopu JEOL 100S byly zhotoveny ultratenké řezy, které byly protibarveny citrátem olovnatým.

Statistické metody

Na data byla použita vícenásobná regresní analýza pro zjištění vlivu jednotlivých parametrů na výsledek. Pro několik korelací byly vypočteny Spearmanovy rankové korelační koeficienty. Pro porovnání skupin byl proveden Wilcoxonův rank-sum test na rozdíl mediánů.

Výsledky

V tabulce I jsou uvedeny obsahy zinku, hořčíku a vápníku a relativní zastoupení těchto kationtů v seminální plazmě. Porovnání mediánů těchto parametrů u obou skupin S-TTP versus L-TTP pomocí dvouvýběrových t-testů neodhalilo statisticky významné rozdíly u žádného z těchto parametrů. Silná pozitivní vzájemná korelace byla zjištěna mezi zinkem, hořčíkem a vápníkem (Spearmanovy rankové korelační koeficienty byly 0,79-0,86, P < 0,01) (obr. 1).

Žádný z kationtů nebyl v těsné korelaci s žádným z konvenčních parametrů spermatu. Při provedení vícenásobné regresní analýzy všech údajů vyšel pouze obsah zinku s hodnotou P pod 0,05 pro následující parametry CASA: VSL 0,04 a LIN 0,008. Zadání hořčíku nebo vápníku do modelu hodnoty nezlepšilo.

Vzorky spermatu byly rozděleny do dvou stejně velkých skupin podle stavu jednotlivých kationtů. Byly stanoveny následující dělící body (mediány pro všech 50 vzorků): zinek 112 mg/l, hořčík 98 mg/l a vápník 476 mg/l. Mezi oběma skupinami byla zjištěna řada statisticky významných rozdílů (tabulka II). P-hodnoty pro skupiny zinku naznačily největší rozdíly, skupiny vápníku měly střední rozdíly a skupiny hořčíku vykazovaly jen slabé rozdíly (kromě LIN).

Pro relativní podíl mezi kationty (tabulka III) byly dělící body: zinek:hořčík 1,26 a zinek:vápník 0,22. V tabulce III jsou uvedeny rozdíly mezi skupinami zinku a vápníku. Vzorky s poměrem zinek:vápník vyšším než 0,22 vykazovaly statisticky významně nižší hodnoty parametrů CASA VSL, LIN a STR ve srovnání se vzorky s poměrem nižším než 0,22. Vzorky s poměrem zinek:vápník vyšším než 0,22 vykazovaly statisticky významně nižší hodnoty parametrů CASA. Korelace zinek:hořčík je 0,86 (Spearmanův korelační koeficient) a pro zinek:vápník je 0,79. V případě zinku a vápníku je korelace 0,79. Zdá se, že obsah zinku je těsněji spojen s obsahem hořčíku než s obsahem vápníku, což by mohlo vysvětlit rozdíl mezi skupinami.

Při hodnocení obsahu zinečnatých iontů v preparátech AMG byl zjištěn rozdíl na světelné mikroskopické úrovni u vzorků s nízkým obsahem celkového zinku ve srovnání se vzorky s vysokým obsahem celkového zinku. Obrázek 2 ukazuje rozdíly v barvení AMG u vzorku s 299 mg/l a vzorku s 53 mg/l semenného zinku. Bylo zjištěno, že barvení kolem akrozomu, ocásku a v semenné plazmě je u vzorků s nízkým obsahem celkového zinku řídké. Tato zjištění nebylo možné potvrdit na úrovni elektronového mikroskopu (obrázek 3A) a zejména nebyl pozorován žádný rozdíl v intracelulárním zbarvení spermií. Obrázky 3B a 4 ukazují lokalizaci iontů zinku v ocásku spermií. Nachází se v celém ocásku a koncentruje se v bičíkatých akcesorních vláknech a v membráně. V semenné plazmě byla zjištěna tělíska mikrometrových rozměrů bohatá na obsah zinečnatých iontů (obrázek 5).

Diskuse

Tato studie je podle našeho nejlepšího vědomí první, která hodnotí vliv semenného zinku, hořčíku a vápníku na parametry TTP a CASA u zdravých lidí. Byla zjištěna souvislost mezi vysokými koncentracemi zinku a nízkou linearitou pohybu spermií vyjádřenou poklesem VAP, VSL, STR a LIN. Koncentrace hořčíku a vápníku úzce souvisely s koncentrací zinku, ale nebyly tak silně spojeny s parametry CASA. Bylo zjištěno, že celková koncentrace zinku, hořčíku a vápníku nemá na pohyblivost žádný vliv. Byly však zjištěny rozdíly mezi vysokým a nízkým obsahem zinku a některými parametry CASA (tabulka II). Při porovnání 25 vzorků spermatu s nejnižší hodnotou celkového zinku (medián 72 mg/l) s 25 vzorky s nejvyšší hodnotou celkového zinku v spermatu (medián 187 mg/l) byl Wilcoxonovým rank-sum testem zjištěn statisticky významný rozdíl v mediánech pro VSL (P = 0,004) i LIN (P = 0,001). U VAP byl rozdíl rovněž významný (P = 0,02). U VCL nebyl zjištěn žádný rozdíl. Vzhledem k tomu, že u vzorků s nízkým a vysokým obsahem zinku nebyly zjištěny žádné rozdíly v procentech pohyblivosti ani v koncentraci pohyblivých buněk, zdá se tedy, že prostředí bohaté na zinek způsobuje, že se spermie pohybují více náhodně a méně dopředu. Nezdá se, že by snižoval počet pohyblivých spermatických buněk.

VSL vyjadřuje, jak daleko přímo vpřed se spermatická buňka za určitý čas pohybuje, a z klinického hlediska je s největší pravděpodobností nejdůležitějším parametrem CASA. Studie Moora a Akhondiho (1996) o oplozovací schopnosti epididymálních spermií potkana ukázala, že pokles VSL je vysoce negativně korelován s výsledkem oplození in vitro.

V průběhu let se hodně diskutovalo o úloze zinku v semenné plazmě na funkci spermií. V hlavičce spermie se hromadí mnohonásobně vyšší koncentrace než v seminální plazmě a zinek je nezbytný pro stabilitu chromatinu a schopnost chromatinu dekondenzovat ve vhodnou dobu (Kvist, 1982; Kvist a Bjorndahl, 1985; Kvist et al., 1987, 1988) a byla navržena fyziologická role zinku jako konzervačního činitele pro vrozený mechanismus oddělování hlavičky od ocásku (Bjorndahl a Kvist, 1982). O vlivu zinku v semeni na pohyblivost spermií však existují rozporuplné zprávy a většina studií se zabývala kvantitativním hodnocením. Ve studii Lewise-Jonese et al. (1996) byly u 1178 pacientů odeslaných k léčbě neplodnosti měřeny koncentrace zinku a fruktózy v seminální plazmě, ale u zinku nebyla zjištěna statisticky významná souvislost s pohyblivostí. Abou-Shakra et al. (1989) měřili několik stopových prvků v seminální plazmě pomocí ICP-MS, ale nezjistili žádnou korelaci koncentrace zinku v seminální plazmě s hustotou nebo pohyblivostí spermií u normospermických, oligospermických nebo azoospermických mužů. Koncentrace zinku v jejich studii byly podobné hodnotám uvedeným v této studii. Danscher a kol (1978) uvádějí, že vysoké koncentrace zinku jsou spojeny s depresivní pohyblivostí spermií, zatímco jiní uvádějí, že vysoký obsah zinku v seminální plazmě je spojen s vysokým stupněm pohyblivosti spermatických buněk (Stankovic a Mikac-Devic, 1976; Caldamone a kol., 1979).

V této studii jsme se zabývali jak kvantitativním hodnocením celkového zinku, tak kvalitativním stanovením lokalizace iontů zinku ve spermatické buňce a seminální tekutině. Ačkoli na ultrastrukturální úrovni (obr. 2A) nebyly zjištěny žádné rozdíly v obsahu zinečnatých iontů ve spermiích mezi vzorky s vysokým nebo nízkým obsahem celkového zinku, vlastnosti pozorované na světelně mikroskopické úrovni (obr. 1) by mohly odrážet vztah mezi celkovým množstvím zinku a volnými zinečnatými ionty v seminální plazmě. V nedávných studiích Lewis-Jones et al. (1996) a Carpino et al. (1998) dospěli k závěru, že celkový zinek v seminální plazmě je nespolehlivým markerem spermatogenní aktivity, a jako lepší ukazatel navrhují biologicky dostupné zinečnaté ionty vázané na vezikulární vysokomolekulární proteiny. Zde prezentovaná metoda AMG prokazuje chelatovatelný zinek, tj. ionty zinku v plazmě nebo zinek volně vázaný na makromolekuly. Zinek pevně vázaný na proteiny nebude metodou AMG detekován a nemůže být chelatován. Souhlasíme s uvedenými studiemi, že právě biologicky dostupný (tedy chelatovatelný) zinek působí na spermie, včetně jejich pohyblivosti. Tato studie naznačuje, že celkové koncentrace zinku a koncentrace chelatovatelného zinku spolu souvisejí. Jsou nutné další studie a důležitým nástrojem by mohla být počítačová analýza obrazu, např. preparátů AMG.

Na rozdíl od účinků zinku se nezdá, že by vysoká koncentrace hořčíku měla sama o sobě inhibiční účinek na pohyblivost spermií. Byl zjištěn negativní účinek na LIN, který však nebyl natolik velký, aby měl vliv na ostatní parametry CASA. Bylo zjištěno, že lidská semenná plazma obsahuje sekreční granule a vezikuly prostatického původu, které mohou mít regulační účinek na pohyblivost spermií tím, že modulují koncentraci základních kationtů v jejich prostředí (Stegmayr et al., 1982). Membrány těchto organel obsahují Mg2+- a Ca2+-dependentní ATPázu kompetitivně inhibovanou Zn2+ (Ronquist et al., 1978a,b). Již dříve byla zaznamenána vysoká pozitivní korelace mezi zinkem a hořčíkem v seminální plazmě (Papadimas et al., 1983; Umeyama et al., 1986) a v této studii byly zjištěny podobné silné vzájemné korelace mezi všemi třemi kationty (r = 0,79-0,86, P < 0,01).

Vápník je důležitý pro fyziologii spermií včetně jejich pohyblivosti (Morton et al..), 1974; Lindemann et al., 1987), metabolismus (Peterson a Freund, 1976), akrozomovou reakci a oplození (Yanagimachi a Usui, 1974; Yanagimachi, 1981). Úloha semenného vápníku v pohyblivosti spermií však není zcela objasněna. Thomas a Meizel (1988) zjistili, že chelatace extracelulárních vápenatých iontů pomocí EGTA inhibuje akrozomovou reakci, ale zároveň nemá žádný vliv na motilitu. Přidání ionoforu ionomycinu indukujícího akrozomální reakci dvojmocných kationtů nemělo rovněž žádný vliv na pohyblivost, ale významně zvýšilo počet spermií reagujících na akrozomální reakci. Magnus et al. (1990) nezjistili žádnou souvislost mezi koncentrací ionizovaného vápníku a podílem spermií vykazujících progresivní pohyb. Arver a Sjöberg (1982) uvedli, že nízká hladina ionizovaného vápníku je spojena s větším počtem a lepší progresivní pohyblivostí spermií. Prien et al. (1990) porovnávali pohyblivost, rychlost a progresivní pohyb spermií s celkovým a ionizovaným vápníkem u pacientů s normální (>60 %) a sníženou (<60 %) pohyblivostí spermií. Nebyl zjištěn žádný rozdíl v celkovém vápníku, ale u mužů se sníženou pohyblivostí byl zjištěn statisticky významný pokles ionizovaného vápníku v semeni. V této studii byl měřen celkový vápník, ale kapacita semenné plazmy vázat vápník není známa. Stejně jako u vápníku nebyl zjištěn žádný vliv na koncentraci motility a korelace s parametry CASA byla slabší než u zinku (tabulka II). VSL i LIN vykazovaly inverzní významné korelace k celkové koncentraci vápníku (P = 0,02 pro oba), zatímco VCL ovlivněna nebyla. Přidání koncentrace zinku do vícenásobné regresní analýzy však odstranilo vliv celkové koncentrace vápníku na motilitu. To je v souladu s již zmíněnou studií Priena et al. (1990). V této studii vykazovaly vzorky s nízkým poměrem zinku a vápníku statisticky významně lepší hodnoty CASA (VSL, LIN a STR) ve srovnání se vzorky s vysokým poměrem. To je způsobeno především rozdíly v koncentraci zinku.

Přesnost stanovení zinku, hořčíku a vápníku v této studii byla poměrně nízká, s variačními koeficienty 18, 32 a 17 %. Důvodem je pravděpodobně nehomogenita vzorků, která v kombinaci s malými objemy vzorků (20 μl) mohla přesnost zhoršit. Navzdory velké nepřesnosti byly odchylky vzniklé při stanovení zinku a hořčíku ve srovnání s velkým rozsahem koncentrací ve vzorcích malé.

Již dříve bylo prokázáno, že chelatace zinečnatých iontů ovlivňuje pohyblivost spermií u člověka (Danscher a Rebbe, 1974), potkana a psa (Saito a kol., 1967; Stoltenberg a kol., 1997). V současné době se provádějí studie s intra- a extracelulární chelatací zinečnatých iontů, které by mohly odhalit význam umístění zinečnatých iontů v semenné tekutině a ve spermatické buňce.

Autoři by rádi poděkovali paní H.Brandstrup, paní D.Jensen, paní K.Lunding, paní K.Wiedemann, paní Anně Akantis a panu A.Meierovi za zručnou technickou pomoc. Dánská skupina pro studium plodnosti podpořila tuto studii, která je součástí společné navazující studie o environmentálních a biologických determinantách plodnosti. Projekt koordinuje Steno Institute of Public Health, University of Aarhus, a je realizován ve spolupráci s Oddělením růstu a reprodukce, National University Hospital v Kodani. Studie byla podpořena především grantem Výzkumné nadace Aarhuské univerzity (J 1994-7430-1). Další podporu poskytly také Danish Medical Research Council (J 12-2042-1), Danish Health Insurance Foundation (J 11/243-91, J 11/236-93), Fonden til Lægevidenskabens Fremme (A.P.Møller) a The Ciconia Foundation.

.