I 1960’erne blev der nået to milepæle i fysiologien af tarmens sukkerabsorption. Den første var Crane og kollegers Na+-glukose-kotransporthypotese (1), som forklarede aktiv sukkertransport, og den anden var opdagelsen af glukose- og galaktosemalabsorption (GGM) hos patienter (5, 6). Kotransporthypotesen er blevet udtømmende testet, bekræftet og udvidet til at omfatte “aktiv transport” af en lang række substrater ind i celler, lige fra laktoseakkumulering i Escherichia coli til jodidakkumulering i skjoldbruskkirtlen. Kotransportere er grundlæggende set molekylære maskiner, der bruger energi, der er lagret i form af elektrokemiske potentialgradienter i form af ioner på tværs af cellemembraner, Na+ eller H+, til at drive ophobningen af specifikke opløsninger og vand i cellerne (22). Den intestinale Na+-glukosecotransporter (SGLT1) bruger Na+ og elektriske gradienter på tværs af membranen til at drive sukker og vand ind i enterocytter mod deres koncentrationsgradienter (9, 13, 23). Glukose og galaktose håndteres begge af SGLT1, mens fruktose transporteres over børstensgrænsen af sin egen private transportør, den faciliterede fruktosetransportør (GLUT5). Glukose, galaktose og fruktose afslutter deres rejse gennem cellen og ud i blodet gennem en anden faciliteret sukkertransportør (GLUT2) i den basolaterale membran (fig. 1).

GGM er karakteriseret ved neonatal debut af vandig og sur svær diarré, som er dødelig i løbet af få uger, medmindre laktose (glukose og galaktose) fjernes fra kosten (2). Diarréen ophører ved faste eller ved fjernelse af de ulovlige sukkerstoffer fra kosten, men genoptages straks ved oral fodring med diæt, der indeholder laktose, glukose eller galaktose. Absorptionen af fruktose er upåvirket. I betragtning af symptomerne på sygdommen og det, man på det tidspunkt vidste om tarmens sukkerabsorption, forudsagde man, at GGM skyldtes en defekt i Na+-glukose-kotransporteren på børstensgrænsen. Denne hypotese blev styrket af de udsøgte autoradiografiske galaktoseoptagelses- og phlorizinbindingseksperimenter, der blev udført på slimhindebiopsier fra den første amerikanske GGM-patient (17, 18). Disse eksperimenter viste, at reduktionen i galaktosetransporten var forbundet med et 90 % fald i phlorizinbindingen til børstegrænsen. Phlorizin er en specifik, ikke transporteret, kompetitiv inhibitor af SGLT1.

Den mest pålidelige diagnostiske test for GGM er H2-ånde-testen (Fig.2). Oral indgift af glukose eller galaktose (2 g/kg) resulterer i en forhøjelse af H2 i åndedrættet i høj grad over 20 dele/mio. hos patienter med GGM, men ingen sådan forhøjelse hos kontroller eller patienter, der får fruktose. Børn med GGM trives “normalt” med fruktoseerstatning, men symptomerne vender tilbage selv i voksenalderen med så lidt som en teskefuld glukose (6 g), og H2-åndeprøven er fortsat positiv. Sygdommen er ret sjælden. Vi har kendskab til ca. 200 patienter på verdensplan, og en stor del af tilfældene stammer fra slægtskab.

Fysiologien og patofysiologien i intestinal sukkerabsorption blev fremskyndet i 1987 ved vores kloning af Na+-glukose cotransporteren fra kaninen ved hjælp af en ny strategi, som vi kaldte “ekspressionskloning”. Denne succes blev hurtigt fulgt op af Turk og Hedigers kloning (4) af den humane Na+-glukose cotransporter og Turk et al.s identifikation (20) af den første mutation i en transportør, der forårsagede en genetisk sygdom, GGM. Vi har fået tarmbiopsier fra to søstre, der er diagnosticeret med GGM, og blodprøver fra forældrene, som er fætre og kusiner. Turk et al. (20) identificerede en homozygot, missense mutation (Asp28Asn) i SGLT1 cDNA’et fra hver søster, fandt ud af, at hver forælder var bærer af denne mutation, og påviste, at mutationen faktisk helt ophævede Na+-glukosekotransporten ved hjælp af et oocyte ekspressionsassay. I den samme slægt blev der efterfølgende foretaget prænatal screening af to fostre, og det blev konstateret, at det ene foster (den probandens søskende) var bærer af Asp28Asn-mutationen, mens det andet foster (en fætter) var normalt. Begge børn har trives uden kostrestriktion og har været asymptomatiske i mindst to år (11).

Den videre udvikling blev i første omgang hæmmet af vanskeligheder med at opnå slimhindebiopsiprøver fra børn med GGM, indtil det lykkedes Turk et al. (21) at kortlægge hele det humane SGLT1-gen. Genet er stort med 15 exoner fordelt på 72 kb DNA. Da exonerne og deres flankerende regioner var blevet sekventeret, blev der udviklet et enkeltstrenget konformationspolymorfismeassay til screening af patienter for mutationer ved hjælp af genomisk DNA fra en lille blodprøve. Denne udvikling omfattede PCR-amplificering af hver af de 15 exoner og deres intron-exon-forbindelser og gelelektroforese af de denaturerede PCR-produkter for at identificere exoner med mutationer. Anomale exoner blev derefter sekventeret. For at afgøre, om mutationerne var ansvarlige for defekten i sukkertransporten, blev mutanterne udtrykt i Xenopus laevis-oocytter til Na+-glukoseoptagelsesforsøg. Martı́n (Refs. 10, 12, og upublicerede observationer) var i høj grad ansvarlig for denne fase af projektet. Mutationer, der forklarer sygdommen, blev identificeret hos 33 af 34 undersøgte GGM-patienter. Patienterne i 17 slægter bar homozygote mutationer, og i yderligere 10 slægter havde patienterne sammensatte heterozygote mutationer. Disse omfattede 22 missense-mutationer (se fig. 3) og 4 splejsningssted- og 3 nonsense-mutationer, der resulterer i produktion af et stærkt afkortet SGLT1-protein. Den manglende påvisning af mutationer hos den 34. patient kan skyldes, at mutationen var i genets promotorregion, og DNA fra dette område blev ikke medtaget i screeningsproceduren.

Som transportfysiolog har jeg været interesseret i GGM-missense-mutationerne på grund af deres potentiale til at identificere rester i proteinet, der er kritiske for transport. Vi satte os derfor for at bestemme, hvordan missense-mutationer faktisk forårsager defekten i Na+-sukkertransport. I denne fremgangsmåde, som i vid udstrækning blev udført af Lostao (se Refs. 10 og 12), blev de muterede proteiner i X. laevisoocytter udtrykt, hvorefter der blev anvendt biofysiske og biokemiske metoder til at bestemme niveauet af protein i cellen og i plasmamembranen. I de tilfælde, hvor transporteren var indsat i plasmamembranen, undersøgte vi (7) de delvise reaktioner i transportcyklusen. Vi var i første omgang skuffede over at finde, at med de første 21 undersøgte missense-mutanter skyldtes den primære defekt fejltrafikering af transporterne i cellen. På grundlag af Western blots blev alle mutanterne syntetiseret på niveauer svarende til eller højere end wild-type SGLT. Imidlertid viste ladningsmålinger (7) og fryse-fraktur-elektronmikroskopi (24) af oocytplasmamembranen, at der var en alvorlig reduktion i antallet af cotransportere i plasmamembranen (10, 12). Som vurderet ud fra graden af kerne- og kompleksglykosylering af mutanterne skete defekten i trafikken af SGLT1 til plasmamembranen mellem enten det endoplasmatiske retikulum og Golgi eller Golgi og plasmamembranen. Fejlfoldning af mutantproteiner kan være den primære årsag til transportørens fejlsortering (19). I kun ét tilfælde, Gln457Arg, var det mutante protein i oocyttens plasmamembran nær normale niveauer.

Hvilken relevans har disse eksperimenter på oocytter for tarmene hos GGM-patienter? For at besvare dette har vi undersøgt (upublicerede data) fordelingen af SGLT1-protein ved immunocytokemi i slimhindebiopsier fra tre patienter med homozygote mutationer. Hos alle tre var fordelingen af de muterede proteiner i oocytten identisk med fordelingen af SGLT1 i patientens enterocytter: hos to var proteinet i cytoplasmaet, og hos en var proteinet i børstekanten. Der er også overensstemmelse mellem vores resultater på oocytter og de resultater, der er opnået ved autoradiografiske undersøgelser af biopsier fra den første amerikanske GGM-patient (18). Stirling og hans medarbejdere (18) fandt, at bindingen af phlorizin til patientens brush border var reduceret med 90%, og vi fandt ikke noget mutant SGLT1-protein (Cys355Ser og Leu147Arg) i oocyttens plasmamembran (10). Disse undersøgelser tyder på, at i det mindste med disse fire GGM-mutanter genskaber oocytten den adfærd, som det mutante protein har i enterocytten.

Et vigtigt tilbageværende spørgsmål er, hvordan missense-mutationerne fordelt i hele proteinet (Fig. 3) forstyrrer transportens trafikering til plasmamembranen. Svar på dette spørgsmål er vigtigt for at forstå biosyntesen af plasmamembranproteiner og for at udtænke bedre behandlinger til børn med GGM.

GGGM-mutationen i en slægt, Gln457Arg, har givet en uvurderlig indsigt i mekanismen for sukkertransport. Lostao undersøgte (under forberedelse) opførslen af Q457R SGLT1 udtrykt i oocytter og patientens tarmslimhinde og fandt, at proteinet oversættes, glykosyleres og indsættes i plasmamembranen, men at det ikke er i stand til at transportere sukker. I fravær af sukker transporterer det mutante protein Na+ via Na+ leak- eller Na+ uniport-vejen, og dette bliver blokeret af phlorizin. Glukose er også en hæmmer, fordi det også blokerer denne Na+ transportvej, hvilket indikerer, at glukose binder til Q457R SGLT1, men at det ikke transporteres, dvs. at mutationen giver en sukkertranslokationsdefekt. Panayotova-Heiermann og kolleger (15) viste uafhængigt af hinanden, at sukker-“porten” gennem SGLT1 dannes af det COOH-terminale domæne af SGLT1, der bærer rest Q457.

For at udnytte disse observationer har vi undersøgt Q457’s rolle i sukkertranslokation. I denne undersøgelse viste cysteinmutanten Q457C sig at bevare fuld Na+-glukosetransportaktivitet, bortset fra en stigning i den tilsyneladende glukose Michaelis-Menten-konstant (Km) fra 0,4 til 6 mM, og kemisk mutagenese af Q457C med enten ladede eller neutrale alkylerende reagenser (methanethiosulfonater, MTS) viste sig at blokere sukkertransporten fuldstændigt. Da det alkylerede Q457C-protein imidlertid binder glukose med en dissociationskonstant, der er meget lig den tilsyneladende Km for sukkertransport af Q457C SGLT1, må denne rest ikke være en del af sukkerbindingsstedet. Hæmningen af sukkertransport med Q457C ved hjælp af MTS fandt kun sted, når cotransporteren var i den udadvendte Na+-konformation, C2 (Fig.4). Reagenset var ikke effektivt i fravær af Na+, i tilstedeværelse af Na+ og glukose (eller phlorizin) eller i tilstedeværelse af Na+ ved depolariserede membranpotentialer. Spændingsspringforsøg med rhodaminmærket Q457C viste også, at tidsforløbet og fluorescensniveauet nøje fulgte cotransporterens overgang mellem konformationerne C2 og C6 (fig. 4). Vi fortolker disse resultater således, at cotransporteren kan eksistere i mindst tre forskellige konformationer (C6, C2 og C3), og at koblingen mellem Na+- og sukkertransport sker gennem ligand- og spændingsinducerede konformationsændringer i proteinet.

Foreløbige undersøgelser med to andre GGM-missense-mutationer i det COOH-terminale domæne af SGLT1, A468V og R499H (fig. 3), viser, at udskiftning af resterne med cysteiner genopretter trafikken af proteinet til oocytplasmamembranen. Begge proteiner er funktionelle, og sukkertransport er blokeret af MTS-reagenser. Som i tilfældet med Q457C er disse rester kun tilgængelige for MTS-reagenser, når proteinerne befinder sig i C2-konformationen. Disse resultater støtter mit synspunkt, at transmembranhelikserne 10-13 (fig. 3) danner sukkerporen. Der er behov for yderligere arbejde for at identificere Na+-porten.

Sammenfattende har molekylærbiologiske undersøgelser af SGLT1 ført til kloning af cDNA’et for det humane SGLT1 og kortlægning af genet, hvilket har givet nye kraftfulde værktøjer til at undersøge fysiologien af Na+-glukose-kotransport og til at studere GGM. Det er blevet bekræftet, at GGM skyldes mutationer i SGLT1-genet, og de fleste af disse mutationer resulterer enten i afkortet SGLT1-protein eller fejltrafikering af transporteren i cellen. Som forventet for en autosomal recessiv sygdom giver en privat mutation sygdommen i hver slægt, og hyppigheden af sygdommen øges i kulturer med en høj hyppighed af consanguine ægteskaber. Selv om GGM er sjælden, er det muligt, at den større gruppe af personer, der bærer milde SGLT1-mutationer eller alvorlige mutationer på én allel, har nedsat glukose- og galaktoseabsorption. Omkring 10 % af normalpopulationen, medicinstuderende, gav positive glukose H2-åndeprøver (14). Denne grænseflade mellem fysiologi og sygdom har ikke blot øget forståelsen af sukkerabsorptionens patofysiologi, men har også givet nye tilgange til at studere de molekylære mekanismer for koblingen mellem Na+- og sukkertransport gennem plasmamembraner.

FOOTNOTER

• * Første i en serie af indbudte artikler om genetiske forstyrrelser af membrantransport.