Ammoniumacetat-Puffer können im Labor verschiedene Probleme verursachen. Zwei häufige Probleme sind ein überraschender Anstieg des HPLC-MS-Gegendrucks beim Starten des Geräts nach der Lagerung über Nacht und Schwierigkeiten mit der MS-Empfindlichkeit.
Ein erhöhter Gerätegegendruck bei der Verwendung von Ammoniumacetat (und Ammoniumformiat) ist ein häufiges Problem, das in Chromatographieforen festgestellt wurde, insbesondere wenn das Gerät über Nacht oder bei den ersten Läufen eines jeden Tages stand. Hochlösliche wässrige Puffer können viel Kopfzerbrechen verursachen. Sie werden in der Praxis problematisch und verstopfen Kapillaren, Vorsäulen und Endfritten von analytischen Säulen.
Diese Probleme resultieren immer aus einem Missverständnis der Pufferlöslichkeit in gemischten organischen wässrigen Medien. Dies kann mit Hilfe der in Abbildung 1 dargestellten Daten überwunden werden.
Abbildung 1: Löslichkeit von fünf Puffern in Mischungen mit Acetonitril. (Mit Genehmigung von Ref. 1)
Abbildung 1 zeigt deutlich, dass die Löslichkeit von Ammoniumacetat in binären Mischungen, die mehr als 90 % Acetonitril enthalten, zunehmend eingeschränkt und in 100 % Acetonitril völlig unlöslich ist. Während die Löslichkeitsgrenze bei 90 % Acetonitril bei 20 mM Ammoniumacetat liegt, fällt diese Grenze bei 95 % Acetonitril stark auf 10 mM Ammoniumacetat (eine bei LC-MS-Anwendungen häufig verwendete Pufferkonzentration) ab. Das Überschreiten dieser Löslichkeitsgrenzen führt zu einer trüben Flüssigkeit, da sich in der Lösung ein feiner Ammoniumacetat-Niederschlag bildet. Dieser kann Kapillaren und Säulenfritten verstopfen und einen Anstieg des Systemgegendrucks verursachen. Es sollte auch beachtet werden, dass die Daten aus Abbildung 1 unter Verwendung eines hochwertigen Puffers ermittelt wurden – die Löslichkeit nimmt ab, wenn Puffersalzreagenzien von geringerer Qualität (Reinheit) verwendet werden. Versuchen Sie nicht, Ammoniumacetat in reinem Acetonitril zu lösen, auch wenn der Lösung dann Wasser zugesetzt wird. Auch wenn es zunächst den Anschein hat, dass der Puffer löslich ist, wird er schnell aus der Lösung herausfallen (Abbildung 2).
Abbildung 2: Ammoniumacetat-Rückstand, der beim “Lösen” von Ammoniumacetat in Acetonitril entsteht, gefolgt von der Zugabe von Wasser, um das erforderliche organische / wässrige Verhältnis des Eluenten zu erreichen (Foto mit freundlicher Genehmigung von Dr. (Foto mit freundlicher Genehmigung von Dr. Paul Ferguson, Astra Zeneca, UK)
Bei einem typischen Umkehrphasen-HPLC-Gradienten ist dies vielleicht kein so großes Problem, es sei denn, der Gradient geht bis >90% Acetonitril. Es gibt jedoch noch andere Überlegungen, wie z. B. die relativen Prozentsätze an organischem Lösungsmittel, auf die der wässrige Puffer beim Mischen mit Nieder- oder Hochdruck-Mischsystemen treffen kann, bei der Injektion von Proben, die in hohen Prozentsätzen von Acetonitril gelöst sind, oder, im schlimmsten aller Fälle, wenn Systeme mit 100 % Acetonitril gespült werden, um Säulenverunreinigungen zu entfernen oder für die Lagerung über Nacht.
Bei der Verwendung von 100 % Acetonitril für die Säulenlagerung ist außerdem zu bedenken, dass in einem 100 %igen organischen Lösungsmittel große pH-Verschiebungen auftreten können, und es muss darauf geachtet werden, dass diese pH-Verschiebungen den pH-Wert der Säulenlagerung in einen Bereich bringen, in dem die Auflösung der Siliziumdioxidmatrix möglich ist, was zur Bildung von “Feinanteilen” in der Säule führt, die letztlich zu einer Blockierung der Säule (bei hohem pH-Wert) oder zum Strippen der gebundenen Phasenliganden (bei niedrigem pH-Wert) führen.
Ammoniumacetat als Puffer
Viele haben sich für Ammoniumacetat als Puffer entschieden, insbesondere bei der MS-Detektion, da es von Natur aus flüchtig ist und nur eine geringe Neigung zur Verunreinigung durch API-Quellen aufweist. Beachten Sie jedoch diese begrenzte Löslichkeit und passen Sie Ihre HPLC-Praxis entsprechend an. Verstehen Sie, ob die Verwendung von Ammoniumacetat für das Experiment geeignet ist und ob ein Puffer tatsächlich erforderlich ist. Die Anforderungen für die Verwendung und die geeignete Wahl und Konzentration eines Puffers werden häufig missverstanden. Ammoniumacetat ist ein gutes Beispiel, um die Verwendung und den Missbrauch dieses beliebten Puffersystems zu untersuchen.
Puffer werden benötigt, um kleinen pH-Änderungen (in erster Linie des Elutionsmittels) zu widerstehen und um sicherzustellen, dass die HPLC-Säule in einem Zustand konstanter Ladung bleibt (in erster Linie der Ionisierungszustand der restlichen Silanolspezies auf der Oberfläche des Silikat-Trägers). Änderungen des pH-Werts können Probleme mit der Stabilität der Retentionszeit, der Peakform und (bei Verwendung von Electrospray MS) der Empfindlichkeit des Geräts verursachen. Die größte “Herausforderung” für den pH-Wert des Systems entsteht in der Regel durch die Vermischung des Probenverdünners mit dem Eluenten in den Verbindungselementen zwischen dem Injektor und der HPLC-Säule (oder Vorsäule) und am Kopf der Säule. Wenn das Probenverdünnungsmittel einen anderen pH-Wert hat, kann der Analyt (oder ein Teil der Analytmoleküle) seinen Ionisierungszustand ändern und dadurch anders chromatographieren oder an der MS-Schnittstelle anders reagieren. Es ist jedoch wichtig, die Chemie unserer Analysemethode zu verstehen, um kritische Entscheidungen über die Art und Konzentration des Puffers treffen zu können. Die Analytkonzentrationen und die Menge der Säulenoberfläche, die eine pH-Kontrolle erfordern, sind so gering, dass nur eine sehr niedrige Pufferkonzentration erforderlich ist, um reproduzierbare Retentionszeiten, eine akzeptable Peakform und die Nachweisempfindlichkeit aufrechtzuerhalten.
Abbildung 3 zeigt die Situationen, in denen Ammoniumacetat sowohl in der Chromatographie als auch in der Massenspektrometrie von Nutzen sein kann.
Abbildung 3: Variation der Pufferkapazität für wässrige Ammoniumacetatlösung (10mM) mit verschiedenen Anteilen von Acetonitril (%) (Adaptiert mit Genehmigung von Ref. 2)
Es gibt im Wesentlichen zwei Pufferbereiche, wenn 10mM Ammoniumacetat zu unserer Elutionslösung hinzugefügt wird und entweder verdünnter Ammoniak oder Ameisensäure zur Einstellung des pH-Werts verwendet wird. Ohne die Zugabe von Säuren oder Basen hat die Lösung nur eine sehr geringe Pufferkapazität.
In 100 %iger wässriger Lösung liegen die Puffer-PKa-Werte zwischen 4,8 und 9,5. Der Puffer wird am besten im Bereich von +/- 1 pH-Einheit vom Puffer-pKa-Wert verwendet, wo die Pufferkapazität auf etwa 66 % reduziert wird. Bei einer Abweichung von 2 pH-Einheiten vom Puffer-pKa verringert sich die Pufferkapazität auf etwa 5 %. Bei einem Ammoniumacetatpuffer in Wasser sollte der pH-Wert des Eluenten für die Trennung 3,8 bis 5,8 betragen, wenn Ameisensäure als pH-Modifikator verwendet wird, und 8,5 bis 10,5, wenn Ammoniak zur Einstellung des pH-Werts des Eluenten verwendet wird. Die Einschränkung: Sobald Acetonitril dem System hinzugefügt wird, ändert sich dieser Arbeitsbereich und der nutzbare pH-Bereich wird 5,2 bis 7,2 oder 7,9 bis 9,9 bei 60 % Acetonitril. Bei Gradiententrennungen wird sich der pKa des Puffersystems ständig ändern. Der pKa-Wert des Systems bei der anfänglichen Gradientenzusammensetzung wird verwendet, um die Brauchbarkeit des Puffers für die Trennung abzuschätzen.
Werden diese pH-Bereiche ausreichen, um Änderungen des Ausmaßes der Analytionisierung oder Änderungen der Säulenprotonierung zu vermeiden? Das ist die Schlüsselfrage.
Für die MS-Detektion führen ionogene Analyten in ionisierter Form zu einer guten Nachweisempfindlichkeit, während die Retention in der Umkehrphase durch eine umsichtige Wahl der stationären Phase und der Art und Zusammensetzung des organischen Lösungsmittels gesteuert wird. Wenn der Analyt bei den oben (und in Abbildung 3) vorgeschlagenen pH-Bereichen vollständig ionisiert ist, ergeben sich gute chromatographische und Nachweisleistungen. Aus Abbildung 1 ist ersichtlich, dass die Pufferkapazität des Systems mit der Zugabe von Acetonitril abnimmt, wobei die Pufferkapazität bei 60 % Acetonitril auf 30 % des wässrigen Wertes sinkt. Der wichtigste Grundsatz bei der Verwendung von Puffer in der LC-MS besteht darin, so wenig wie möglich zu verwenden, um die Reproduzierbarkeit der Retentionszeit, eine akzeptable Peakform und die Empfindlichkeit des Detektors zu erhalten. Die Pufferkonzentration hat einen direkten Einfluss auf das Ausmaß der Ionensuppression und damit auch auf die Empfindlichkeit der Methode. Um eine gute Pufferkapazität bei niedrigeren Pufferkonzentrationen aufrechtzuerhalten, versuchen wir oft, innerhalb von +/- 0,5 Einheiten des Puffer-pKa zu arbeiten.
Tabelle 1 zeigt die empfohlenen pH-Bereiche, in denen Ammoniumacetatpuffer nützlich sind.
| % MeCN | Maximaler Pufferkapazitätsbereich (Essigsäure / Acetat) | Maximaler Pufferkapazitätsbereich (Ammonium / Ammoniak) | Pufferkapazität (% relativ zu 100% Aq-Lösung) |
| 0 | 4.2 – 5.2 | 9.0 – 10.0 | 100 |
| 20 | 4.7 – 5.7 | 8.7 – 9.7 | 80 |
| 40 | 5.0 – 6,0 | 8,5 – 9,5 | 50 |
| 60 | 5,6 – 6,6 | 8,3 – 9,3 | 30 |
Tabelle 1: Empfohlene pH-Arbeitsbereiche und indikative relative Pufferkapazitäten für 0,1mM Ammoniumacetat (aq) / Acetonitril-Eluentensysteme.
Verwenden Sie die Pufferbereiche aus Tabelle 1, um den pH-Wert des Eluenten auszuwählen, bei dem der Analyt zu 100 % ionisiert sein sollte. Beachten Sie, dass die Pufferkonzentration, die zur Ableitung dieser Zahlen verwendet wurde, 0,1 mM beträgt – eine gängige Wahl für die Pufferkonzentration bei der Verwendung von MS-Detektion. Bei basischen Analyten ist das Essigsäure/Acetat-Puffersystem üblich, und der pH-Wert des Elutionsmittels liegt in der Regel deutlich unter dem pKa-Wert der basischen Analyten, so dass diese ständig protoniert werden. Das Gleiche gilt für saure Analyten mit dem Ammonium/Ammoniak-System, bei dem alle sauren Analyten vollständig deprotoniert sein sollten. Dadurch wird sichergestellt, dass die Retentionszeiten konstant sind, die Peakformen gesund sind und die MS-Empfindlichkeit aus methodenchemischer Sicht optimiert ist.
Es gibt große Lücken in den effektiven Pufferbereichen für Eluenten auf Ammoniumacetatbasis. Das heißt, bei einer 20 %igen Acetonitril-Eluentenzusammensetzung (oder einer 20 %igen Ausgangsgradientenzusammensetzung) ist die Pufferkapazität bei einem Eluenten-pH-Wert unter 4,2, zwischen 5,2 und 9,0 oder über 10,0 wahrscheinlich geringer (es müssen höhere Pufferkonzentrationen verwendet werden). Es gibt andere Methoden, bei denen der pH-Wert des Eluenten bei Verwendung von Ammoniumacetatpuffern außerhalb dieser empfohlenen Bereiche eingestellt wird. Ziehen Sie die Verwendung eines anderen Puffersystems in Betracht – das Format/Ameisensäure-System ist eine beliebte Wahl bei Eluenten-pH-Werten unter 4,2.
Sollte immer ein Puffer verwendet werden?
Wenn der Eluenten-pH-Wert weit vom pKa-Wert des Analyten entfernt ist, haben kleine Änderungen des Eluenten-pH-Werts eine vernachlässigbare Auswirkung auf den Grad der Analytionisierung. Unter diesen Umständen kann die Verwendung eines Puffers überflüssig sein. Essigsäure (sowie Ameisen-, Trifluor- und Difluoressigsäure) haben beispielsweise eine beträchtliche “Selbstpufferungs”-Kapazität bei niedrigem pH-Wert und liefern dem basischen Analyten einen pKa-Wert >2 pH-Einheiten höher und dem sauren Analyten einen pKa-Wert
Dies alles setzt voraus, dass basische Analyten mit einem sauren Eluentensystem und saure Analyten mit einem basischeren pH-Wert des Eluentensystems analysiert werden, um eine vollständige Ionisierung und eine gute Elektrospray-MS-Empfindlichkeit sicherzustellen. Wenn es Probleme mit dem Gegendruck des Geräts, der Instabilität der Retentionszeit oder der MS-Detektionsempfindlichkeit gibt, kann es sich durchaus lohnen, darüber nachzudenken, ob überhaupt ein Puffersalz erforderlich ist. Der vernünftige Einsatz von Ameisen- oder Essigsäure oder Ammoniaklösung kann alle Probleme lösen.
Was auch immer der Fall ist, nehmen Sie sich die Zeit, die Chemie der Methode im Hinblick auf den pKa-Wert Ihres Analyten, den erforderlichen pH-Wert des Elutionsmittels und die Wahl des Puffersystems zu verstehen, das verwendet wird, um diesen pH-Wert innerhalb des Systems zu erreichen und aufrechtzuerhalten.
Für diejenigen, die keine pKa-Informationen über den Analyten haben, gibt es eine Reihe kostenloser Programme, die eine vernünftige Arbeit bei der Vorhersage des pKa-Werts des Analyten auf der Grundlage der Struktur leisten. In unseren Labors werden häufig verwendet:
- ChemSketch – https://www.acdlabs.com/resources/freeware/chemsketch/
- MarvinSketch – https://chemaxon.com/products/marvin
Wenn Sie ein tieferes Verständnis für Puffer und ihre Verwendung in der HPLC und LC-MS suchen, lesen Sie die Artikel in den Verweisen 3-6.
Solubility of Buffers in Aqueous-Organic Eluents for Reversed-Phase Liquid Chromatography, Adam P. Schellinger und Peter W. Carr, LCGC North America Volume 22 Number 6 June 2004
Buffer Considerations for LC and LC-MS, Xavier Subirats, Elisabeth Bosch, and Marti Rosés, LCGC North America Volume 27 Number 11 November 2009
Mobile-Phase Buffers, Part I – The Interpretation of pH in Partially Aqueous Mobile Phases, LCGC North America Volume 20 Number 11 November 2002
Mobile-Phase Buffers, Part II – Buffer Selection and Capacity, LCGC North America Volume 20 Number 12 December 2002
Mobile-Phase Buffers, Part III – Buffer Selection and Capacity, LCGC North America Volume 21 Number 1 January 2003
Mobile Phase Buffers in LC: Effect of Buffer Preparation Method on Retention Repeatability, LCGC North America Volume 37, Issue 7, July 2019