AFLATOXINE : Vorkommen und Gesundheitsrisiken

Aflatoxine sind giftige Stoffwechselprodukte, die von bestimmten Pilzen in/auf Lebens- und Futtermitteln gebildet werden. Sie sind wahrscheinlich die bekanntesten und am intensivsten erforschten Mykotoxine der Welt. Aflatoxine werden weltweit mit verschiedenen Krankheiten wie Aflatoxikose bei Nutztieren, Haustieren und Menschen in Verbindung gebracht. Das Auftreten von Aflatoxinen wird von bestimmten Umweltfaktoren beeinflusst; daher hängt das Ausmaß der Kontamination von der geografischen Lage, den landwirtschaftlichen und agronomischen Praktiken und der Anfälligkeit der Waren für Pilzbefall während der Vorernte-, Lager- und/oder Verarbeitungszeit ab. Aflatoxine haben aufgrund ihrer nachgewiesenen potenziell karzinogenen Wirkung bei anfälligen Labortieren und ihrer akuten toxikologischen Auswirkungen beim Menschen mehr Aufmerksamkeit erhalten als alle anderen Mykotoxine. Da man erkannt hat, dass eine absolute Sicherheit niemals erreicht werden kann, haben viele Länder versucht, die Exposition gegenüber Aflatoxinen zu begrenzen, indem sie für Waren, die zur Verwendung als Lebens- und Futtermittel bestimmt sind, gesetzliche Grenzwerte festgelegt haben.

Einleitung

In den 1960er Jahren starben in England innerhalb weniger Monate mehr als 100.000 junge Truthähne in Geflügelfarmen an einer scheinbar neuen Krankheit, die als “Turkey X disease” bezeichnet wurde. Es stellte sich bald heraus, dass das Problem nicht auf Puten beschränkt war. Auch Entenküken und junge Fasane waren betroffen, und es kam zu einer hohen Sterblichkeitsrate.

Eine sorgfältige Untersuchung der ersten Ausbrüche zeigte, dass sie alle mit Futtermitteln, nämlich brasilianischem Erdnussmehl, in Verbindung standen. Eine intensive Untersuchung des verdächtigen Erdnussmehls wurde durchgeführt, und es stellte sich schnell heraus, dass dieses Erdnussmehl für Geflügel und Entenküken hochgiftig war und die typischen Symptome der Truthahn-X-Krankheit aufwies.

Spekulationen, die 1960 über die Art des Toxins angestellt wurden, deuteten darauf hin, dass es pilzlichen Ursprungs sein könnte. Tatsächlich wurde der toxinproduzierende Pilz als Aspergillus flavus (1961) identifiziert, und das Toxin erhielt aufgrund seiner Herkunft den Namen Aflatoxin (A.flavis–>Afla).

Diese Entdeckung hat zu einem wachsenden Bewusstsein für die potenziellen Gefahren dieser Stoffe als Verunreinigungen von Lebens- und Futtermitteln geführt, die bei Menschen und anderen Säugetieren Krankheiten und sogar den Tod verursachen können. Die in den folgenden Abschnitten zusammengefassten Studien ergaben, dass Aflatoxine in erster Linie von einigen Stämmen von A. flavus und von den meisten, wenn nicht allen Stämmen von A. parasiticus sowie den verwandten Arten A. nomius und A. niger produziert werden. Darüber hinaus haben diese Untersuchungen ergeben, dass es vier große Aflatoxine gibt: B1, B2, G1, G2 sowie zwei weitere Stoffwechselprodukte, M1 und M2, die als direkte Kontaminanten von Lebens- und Futtermitteln von Bedeutung sind. Die Aflatoxine M1 und M2 wurden erstmals aus der Milch von laktierenden Tieren isoliert, die mit Aflatoxin-Zubereitungen gefüttert wurden; daher die Bezeichnung M. Die Bezeichnung B für die Aflatoxine B1 und B2 ergab sich aus der blauen Fluoreszenz unter UV-Licht, während sich die Bezeichnung G auf die gelb-grüne Fluoreszenz der entsprechenden Strukturen unter UV-Licht bezieht. Diese Toxine weisen eine sehr ähnliche Struktur auf und bilden eine einzigartige Gruppe hoch sauerstoffhaltiger, natürlich vorkommender heterozyklischer Verbindungen. Ihre aus Elementaranalysen und massenspektrometrischen Bestimmungen ermittelten Molekularformeln lauten:

• B1 : C17 H12 O6
• B2 : C17 H14 O6
• G1 : C17 H12 O7
• G2 : C17 H14 O7

Die Aflatoxine B2 und G2 wurden als die Dihydroxyderivate von B1 bzw. G1 nachgewiesen. Aflatoxin M1 hingegen ist 4-Hydroxy-Aflatoxin B1 und Aflatoxin M2 ist 4-Dihydroxy-Aflatoxin B2.

Vorkommen

In landwirtschaftlichen Rohprodukten:

Aflatoxine treten häufig in Feldfrüchten vor der Ernte auf. Eine Kontamination nach der Ernte kann auftreten, wenn die Trocknung der Ernte verzögert wird und während der Lagerung der Ernte, wenn das Wasser die für das Schimmelpilzwachstum kritischen Werte überschreiten darf. Insekten- oder Nagetierbefall erleichtert das Eindringen von Schimmelpilzen in einige gelagerte Waren.

Aflatoxine werden gelegentlich in Milch, Käse, Mais, Erdnüssen, Baumwollsamen, Nüssen, Mandeln, Feigen, Gewürzen und einer Vielzahl anderer Lebens- und Futtermittel nachgewiesen. Milch, Eier und Fleischerzeugnisse sind manchmal kontaminiert, weil die Tiere mit Aflatoxin kontaminiertes Futter zu sich nehmen. Die Rohstoffe mit dem höchsten Risiko einer Aflatoxinkontamination sind jedoch Mais, Erdnüsse und Baumwollsaat.

In verarbeiteten Lebensmitteln:

Mais ist wahrscheinlich die Ware, die weltweit die größte Besorgnis erregt, da er in Klimazonen angebaut wird, in denen eine ganzjährige Kontamination mit Aflatoxinen wahrscheinlich ist, und Mais das Grundnahrungsmittel vieler Länder ist. Die bei der Verarbeitung von Mais angewandten Verfahren tragen jedoch dazu bei, die Kontamination der daraus hergestellten Lebensmittel zu verringern. Denn obwohl Aflatoxine in den meisten Lebensmittelprozessen stabil bis mäßig stabil sind, sind sie in Prozessen wie der Herstellung von Tortillas, die alkalische Bedingungen oder oxidierende Schritte beinhalten, instabil. Mit Aflatoxin kontaminierter Mais und Baumwollsamenschrot in Milchrationen haben zu mit Aflatoxin M1 kontaminierter Milch und Milchprodukten geführt, einschließlich fettfreier Trockenmilch, Käse und Joghurt.

Faktoren, die die Aflatoxinproduktion begünstigen

Pilzwachstum und Aflatoxinkontamination sind die Folge von Wechselwirkungen zwischen dem Pilz, dem Wirt und der Umwelt. Die geeignete Kombination dieser Faktoren bestimmt den Befall und die Besiedlung des Substrats sowie die Art und Menge des gebildeten Aflatoxins. Für das Pilzwachstum und die anschließende Toxinbildung ist jedoch ein geeignetes Substrat erforderlich, obwohl die genauen Faktoren, die die Toxinbildung auslösen, noch nicht genau bekannt sind. Wasserstress, hohe Temperaturen und Insektenschäden an der Wirtspflanze sind wichtige Faktoren für den Schimmelbefall und die Toxinbildung. Ebenso wurden bestimmte Wachstumsstadien der Pflanzen, geringe Fruchtbarkeit, hohe Pflanzendichten und Unkrautkonkurrenz mit erhöhtem Schimmelwachstum und Toxinbildung in Verbindung gebracht. Die Aflatoxinbildung wird auch durch das Wachstum anderer Schimmelpilze oder Mikroben beeinflusst. So wird beispielsweise die Aflatoxinkontamination von Erdnüssen und Mais vor der Ernte durch hohe Temperaturen, anhaltende Trockenheit und hohe Insektenaktivität begünstigt, während die Aflatoxinbildung bei Mais und Erdnüssen nach der Ernte durch warme Temperaturen und hohe Feuchtigkeit begünstigt wird.

Aflatoxikose und Tiergesundheit

Aflatoxikose ist in erster Linie eine Erkrankung der Leber. Die Anfälligkeit der einzelnen Tiere für Aflatoxine ist je nach Art, Alter, Geschlecht und Ernährung sehr unterschiedlich. Aflatoxine verursachen Leberschäden, eine verringerte Milch- und Eierproduktion, wiederkehrende Infektionen infolge der Unterdrückung des Immunsystems (z. B. Salmonellose) sowie Embryotoxizität bei Tieren, die niedrige Konzentrationen über die Nahrung aufnehmen. Während die Jungtiere einer Spezies am anfälligsten sind, sind alle Altersgruppen betroffen, wenn auch in unterschiedlichem Ausmaß bei den verschiedenen Arten. Zu den klinischen Anzeichen einer Aflatoxikose bei Tieren gehören gastrointestinale Funktionsstörungen, verminderte Reproduktionsfähigkeit, verminderte Futterverwertung und -effizienz, Anämie und Gelbsucht. Säugende Tiere können infolge der Umwandlung von Aflatoxin B1 in das in der Milch von Milchkühen ausgeschiedene Metabolitenaflatoxin M1 betroffen sein.

Die Auslösung von Krebs durch Aflatoxine wurde eingehend untersucht. Es wurde nachgewiesen, dass Aflatoxin B1, Aflatoxin M1 und Aflatoxin G1 bei verschiedenen Tierarten verschiedene Arten von Krebs verursachen. Die Internationale Agentur für Krebsforschung (IARC) geht jedoch davon aus, dass nur Aflatoxin B1 ausreichende Beweise für die Karzinogenität bei Versuchstieren erbracht hat, um als Karzinogen eingestuft zu werden.

Aflatoxine und die menschliche Gesundheit

Menschen sind Aflatoxinen durch den Verzehr von Lebensmitteln ausgesetzt, die mit Pilzprodukten kontaminiert sind. Eine solche Exposition lässt sich nur schwer vermeiden, da das Pilzwachstum in Lebensmitteln nicht leicht zu verhindern ist. Obwohl stark kontaminierte Lebensmittel in den Industrieländern nicht auf dem Markt zugelassen sind, bleibt die Besorgnis über die möglichen schädlichen Auswirkungen einer langfristigen Exposition gegenüber niedrigen Aflatoxinwerten in Lebensmitteln bestehen.
Nachweise von akuter Aflatoxikose beim Menschen wurden aus vielen Teilen der Welt gemeldet, insbesondere aus Ländern der Dritten Welt wie Taiwan, Ouganda, Indien und vielen anderen. Das Syndrom ist gekennzeichnet durch Erbrechen, Bauchschmerzen, Lungenödem, Krämpfe, Koma und Tod mit Hirnödem und fetthaltiger Beteiligung der Leber, der Nieren und des Herzens.

Zu den Bedingungen, die die Wahrscheinlichkeit einer akuten Aflatoxikose beim Menschen erhöhen, gehören die begrenzte Verfügbarkeit von Lebensmitteln, Umweltbedingungen, die die Entwicklung von Pilzen in Nutzpflanzen und Rohstoffen begünstigen, und das Fehlen von Regulierungssystemen für die Überwachung und Kontrolle von Aflatoxinen.

Da Aflatoxine, insbesondere Aflatoxin B1, bei einigen Tieren stark krebserregend sind, besteht Interesse an den Auswirkungen einer langfristigen Exposition gegenüber geringen Mengen dieser wichtigen Mykotoxine auf den Menschen. Im Jahr 1988 setzte die IARC Aflatoxin B1 auf die Liste der Humankarzinogene. Dies wird durch eine Reihe von epidemiologischen Studien in Asien und Afrika gestützt, die einen positiven Zusammenhang zwischen Aflatoxinen in der Nahrung und Leberzellkrebs (LCC) nachgewiesen haben. Darüber hinaus kann die Ausprägung von aflatoxinbedingten Erkrankungen beim Menschen durch Faktoren wie Alter, Geschlecht, Ernährungszustand und/oder gleichzeitige Exposition gegenüber anderen Erregern wie Virushepatitis (HBV) oder Parasitenbefall beeinflusst werden.

Neuere Analysemethoden für Aflatoxine in Lebensmitteln und Futtermitteln

Probenahme und Probenvorbereitung:

Probenahme und Probenvorbereitung sind nach wie vor eine erhebliche Fehlerquelle bei der analytischen Identifizierung von Aflatoxinen. Daher ist eine systematische Vorgehensweise bei der Probenahme, Probenvorbereitung und Analyse unbedingt erforderlich, um Aflatoxine im Promillebereich zu bestimmen. In dieser Hinsicht wurden für einige Erzeugnisse wie Mais, Erdnüsse und Baumnüsse spezielle Pläne entwickelt und eingehend getestet; die Probenahmepläne für einige andere Erzeugnisse wurden diesen nachempfunden. Allen Probenahmeplänen ist gemeinsam, dass die gesamte Primärprobe gemahlen und gemischt werden muss, damit der analytische Teil der Probe die gleiche Toxinkonzentration aufweist wie die ursprüngliche Probe.

Festphasenextraktion:

Alle Analyseverfahren umfassen drei Schritte: Extraktion, Reinigung und Bestimmung. Die wichtigste neuere Verbesserung des Reinigungsschritts ist die Verwendung der Festphasenextraktion.
Testextrakte werden vor der instrumentellen Analyse (Dünnschicht- oder Flüssigkeitschromatographie) gereinigt, um koextrahierte Stoffe zu entfernen, die häufig die Bestimmung der Zielanalyten stören.

Dünnschichtchromatographie :

Die Dünnschichtchromatographie (TLC), auch bekannt als Flachbettchromatographie oder planare Chromatographie, ist eine der am häufigsten verwendeten Trenntechniken in der Aflatoxinanalyse. Seit 1990 gilt sie als offizielle AOAC-Methode und ist die Methode der Wahl für die Identifizierung und Quantifizierung von Aflatoxinen in Konzentrationen von bis zu 1 ng/g. Die TLC-Methode wird auch zur Überprüfung der Ergebnisse durch neuere, schnellere Techniken verwendet.

Flüssigchromatographie :

Die Flüssigchromatographie (LC) ähnelt der TLC in vielerlei Hinsicht, einschließlich der Anwendung des Analyten, der stationären Phase und der mobilen Phase. Flüssigchromatographie und TLC ergänzen sich gegenseitig. Es ist nicht ungewöhnlich, dass ein Analytiker die TLC für Vorarbeiten zur Optimierung der LC-Trennbedingungen einsetzt.
Flüssigchromatographische Methoden zur Bestimmung von Aflatoxinen in Lebensmitteln umfassen Normalphasen-LC (NPLC), Umkehrphasen-LC (RPLC) mit Vor- oder Nachsäulenderivatisierung (BCD), RPLC mit anschließender Nachsäulenderivatisierung (PCD) und RPLC mit elektrochemischer Detektion.

Immunchemische Methoden:

Dünnschichtchromatographie und LC-Methoden zur Bestimmung von Aflatoxinen in Lebensmitteln sind mühsam und zeitaufwendig. Häufig erfordern diese Verfahren Kenntnisse und Erfahrungen mit chromatographischen Techniken, um Trennungs- und Interferenzprobleme zu lösen. Dank der Fortschritte in der Biotechnologie sind jetzt hochspezifische Tests auf Antikörperbasis im Handel erhältlich, mit denen Aflatoxine in Lebensmitteln in weniger als 10 Minuten nachgewiesen und gemessen werden können. Diese Tests beruhen auf der Affinität der monoklonalen oder polyklonalen Antikörper für Aflatoxine. Die drei Arten von immunchemischen Methoden sind der Radioimmunoassay (RIA), der Enzymimmunoassay (ELISA) und der Immunaffinitätssäulentest (ICA).

Bestätigung der Aflatoxin-Identität:

Auch wenn die Analysemethoden aus unterschiedlichen Extraktions-, Reinigungs- und Quantifizierungsschritten bestehen, sollten die Ergebnisse der Analysen mit diesen Methoden ähnlich sein, wenn sie richtig angewandt werden. Da die Zuverlässigkeit der quantitativen Daten nicht in Frage gestellt wird, besteht das noch zu lösende Problem in der Bestätigung der Identität der Aflatoxine. Die verwendeten Bestätigungsverfahren umfassen entweder die chemische Derivatisierung oder die Massenspektrometrie (MS).

Sicherheitsaspekte beim Umgang mit schimmeligen Körnern und Aflatoxinen:

Die Sicherheit ist ein zentrales Thema für Wissenschaftler, die im Bereich der Aflatoxine arbeiten.Es müssen Schritte unternommen werden, um die Exposition gegenüber den Toxinen sowie den produzierenden Mikroorganismen, Aspergillus flavus und Aspergillusparasiticus, zu minimieren. Es sollte ein Sicherheitsprogramm erstellt werden, das den Anforderungen des Laborstandards der Occupational Safety andHealth Administration (1990) und den Richtlinien der National Institutes of Health (1981) für den Umgang mit chemischen Karzinogenen entspricht.

Überwachungstechniken zur Bewertung der Exposition des Menschen gegenüber Aflatoxinen

In den letzten Jahren wurden neue Technologien entwickelt, die eine genauere Überwachung der individuellen Exposition gegenüber Aflatoxinen ermöglichen. Besondere Aufmerksamkeit wurde der Analyse von Aflatoxin-DNA-Addukten und Albumin-Addukten als Surrogate für die Genotoxizität beim Menschen gewidmet. Autrup et al. (1983) leisteten Pionierarbeit bei der Verwendung der synchronen Fluoreszenzspektroskopie zur Messung von Aflatoxin-DNA-Addukten im Urin. In Urinproben, die nach einer Alfatoxin-Exposition entnommen wurden, fand man 2,3-Dihydroxy-2-(N7-guanyl)-3-hydroxyaflatoxinB1, trivialerweise als AFB-Gual bezeichnet. Wild et al. (1986) verwendeten hochempfindliche Immunoassays zur Quantifizierung von Aflatoxinen in menschlichen Körperflüssigkeiten. Ein enzymgekoppelter Immunoassay (ELISA) wurde zur Quantifizierung von AflatoxinB1 im Bereich von 0,01 ng/ml bis 10 ng/ml verwendet und in Humanurinproben validiert. Mit dieser Methode wurde festgestellt, dass die Ausscheidung von Aflatoxin-DNA-Addukten im Urin positiv mit der Nahrungsaufnahme korreliert, und es wurde gezeigt, dass das im Urin ausgeschiedene Haupt-Aflatoxin-B1-DNA-Addukt ein geeignetes Messinstrument für die Überwachung der Aflatoxin-Exposition über die Nahrung ist.

Kontrolle und Management von Aflatoxinen

A- Regulatorische Kontrolle:

Aflatoxine gelten als unvermeidbare Verunreinigungen von Lebens- und Futtermitteln, selbst wenn die gute Herstellungspraxis eingehalten wurde. Die FDA hat spezifische Richtlinien für akzeptable Aflatoxinwerte in Lebens- und Futtermitteln festgelegt, indem sie Auslösewerte bestimmt hat, die es ermöglichen, die betreffenden Partien aus dem Verkehr zu ziehen. Der Auslösewert für Lebensmittel beträgt 20 ppb Gesamtaflatoxine, mit Ausnahme von Milch, für die ein Auslösewert von 0,5 ppb für Aflatoxin M1 gilt. Der Auslösewert für die meisten Futtermittel liegt ebenfalls bei 20 ppb. Es ist jedoch sehr schwierig, die Aflatoxinkonzentration in einer großenMaterialmenge genau abzuschätzen, da die Testverfahren sehr variabel sind; daher kann die tatsächliche Aflatoxinkonzentration in einer Partie nicht mit 100-prozentiger Sicherheit bestimmt werden.

B- Entgiftungsstrategien:

Da eine Aflatoxinkontamination unvermeidlich ist, wurden zahlreiche Strategien zu ihrer Entgiftung vorgeschlagen. Dazu gehören physikalische Methoden der Abtrennung, thermische Inaktivierung, Bestrahlung, Lösungsmittelextraktion, Adsorption aus Lösungen, mikrobielle Inaktivierung und Fermentation. Chemische Entgiftungsmethoden werden ebenfalls als Hauptstrategie für eine effektive Entgiftung praktiziert:

Strukturabbau nach chemischer Behandlung :
Eine Reihe von Chemikalien wurde auf ihre Fähigkeit getestet, Aflatoxine abzubauen und zu inaktivieren. Einige dieser Chemikalien können Aflatoxine wirksam zerstören (oder abbauen), aber die meisten sind unpraktisch oder potenziell unsicher, weil sie toxische Rückstände bilden oder den Nährstoffgehalt und die organoleptischen Eigenschaften des Produkts beeinträchtigen. Zwei chemische Ansätze zur Entgiftung von Aflatoxinen, die große Beachtung gefunden haben, sind die Ammonisierung und die Reaktion mit Natriumbisulfit.
Zahlreiche Studien belegen, dass die chemische Behandlung durch Ammonisierung eine wirksame Methode zur Entgiftung von mit Aflatoxinen kontaminiertem Mais und anderen Erzeugnissen sein kann. Der Mechanismus für diese Wirkung scheint die Hydrolyse des Lactonrings und die chemische Umwandlung der Stammverbindung Aflatoxin B1 in zahlreiche Produkte zu beinhalten, die eine stark verringerte Toxizität aufweisen.
Andererseits hat sich gezeigt, dass Natriumbisulfit mit Aflatoxinen (B1, G1 und M1) unter verschiedenen Temperatur-, Konzentrations- und Zeitbedingungen reagiert und wasserlösliche Produkte bildet.

Modifikation der Toxizität durch chemische Stoffe in der Nahrung:
Die Toxizität von Mykotoxinen kann stark durch chemische Stoffe in der Nahrung beeinflusst werden, die die normalen Reaktionen von Säugetiersystemen auf diese Stoffe verändern.Eine Vielzahl chemischer Faktoren, darunter Nahrungsbestandteile (z. B. Nahrungsprotein und -fett, Vitamine und Spurenelemente), Lebens- und Futtermittelzusatzstoffe (z. B. Antibiotika und Konservierungsmittel) sowie andere chemische Faktoren können mit den Auswirkungen von Aflatoxinen bei Tieren interagieren.

Änderung der Bioverfügbarkeit durch Aflatoxin-Chemisorbentien:
Ein neuer Ansatz zur Entgiftung von Aflatoxinen ist die Zugabe von anorganischen Sorptionsmitteln, so genannten Chemisorbentien, wie z. B. hydratisiertes Natrium-Calcium-Aluminosilikat (HSCAS), zum Futter der Tiere. HSCAS besitzt die Fähigkeit, Aflatoxine im Magen-Darm-Trakt der Tiere fest zu binden und zu immobilisieren, was zu einer erheblichen Verringerung der Bioverfügbarkeit von Aflatoxinen führt.

Wirtschaftliche Auswirkungen von Aflatoxinen

Die wirtschaftlichen Auswirkungen von Aflatoxinen ergeben sich direkt aus Ernte- und Viehbestandsverlusten sowie indirekt aus den Kosten für Regulierungsprogramme, die die Risiken für die Gesundheit von Mensch und Tier verringern sollen. Die Ernährungs- und Landwirtschaftsorganisation der Vereinten Nationen (FAO) schätzt, dass 25 % der weltweit angebauten Lebensmittel von Mykotoxinen betroffen sind, von denen die Aflatoxine die bekanntesten sind. Die Verluste, die Vieh- und Geflügelzüchter durch Aflatoxin-kontaminierte Futtermittel erleiden, umfassen Todesfälle und die subtileren Auswirkungen einer Unterdrückung des Immunsystems, verringerte Wachstumsraten und Verluste in der Futtereffizienz. Weitere negative wirtschaftliche Auswirkungen von Aflatoxinen sind geringere Erträge bei Lebensmittel- und Faserkulturen.

Darüber hinaus macht die Fähigkeit von Aflatoxinen, Krebs und verwandte Krankheiten beim Menschen zu verursachen, angesichts ihres scheinbar unvermeidlichen Vorkommens in Lebens- und Futtermitteln die Vorbeugung und Entgiftung dieser Mykotoxine zu einem der schwierigsten toxikologischen Themen der Gegenwart.

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