Holzfroschgefrieren

Winterlebensraum

Der Holzfrosch (Rana sylvatica) bewohnt Wälder von den Appalachen bis zu den maritimen Provinzen und im Westen bis zum nördlichen Alaska, sogar bis zum Polarkreis. Sein Überwinterungsquartier ist eine flache Höhle im Waldboden, die weit innerhalb der Frostzone liegt und mit Blättern und anderem organischen Detritus bedeckt ist. Unsere Studien im südlichen Ohio deuten darauf hin, dass Waldfrösche mehreren Frostperioden ausgesetzt sind, die typischerweise mehrere Tage dauern und die Frösche Temperaturen von -2° bis -4°C aussetzen; in nördlicheren Regionen erleben sie jedoch wahrscheinlich viel niedrigere Temperaturen und längere Frostperioden.

Auslösung des Frostes

Es gibt mehrere Mechanismen, die dafür sorgen, dass Waldfrösche frieren, ohne dass es zu einer starken Unterkühlung kommt. Erstens kann das Eis, das den Frosch umgibt, aufgrund der hohen Durchlässigkeit der Amphibienhaut sofort das Gefrieren der Körperflüssigkeiten auslösen. Außerdem beherbergt das Winterquartier des Frosches eine Fülle von Eisbildnern wie verschiedene Mineralpartikel, organische Säuren und bestimmte Mikroben, die den Frosch zum Gefrieren bringen können. Laborexperimente legen nahe, dass die Aufnahme dieser Stoffe die Eisbildung bei frosttoleranten Fröschen fördert. Tatsächlich wurden mehrere Bakterienstämme mit starker eisbildender Aktivität aus dem Darm von im Winter gesammelten Waldfröschen gezüchtet, was darauf hindeutet, dass diese Bakterien während des Winterschlafs erhalten bleiben (Lee et al. 1995). Die Inokulation durch Eis oder Eiskeimbildner in der winterlichen Umgebung ist wahrscheinlich der primäre Mechanismus, der das Einfrieren bei Amphibien auslöst; es besteht kein Bedarf an Eiskeimbildungsproteinen oder anderen endogenen Eiskeimen, wie sie bei einigen Wirbellosen zu finden sind (Costanzo et al. 1999).

Einfrier-/Auftaustress

Ausgedehntes Einfrieren verfestigt Gewebe, unterbricht die Gefäßzirkulation und entzieht den Zellen den Sauerstoff. Da sich Eis nur in extrazellulären Räumen bildet, wird das Wasser in den Zellen osmotisch nach außen gezogen, wo es sich mit dem wachsenden Eisgitter verbindet. Während dieses Prozesses können die Zellen erheblich schrumpfen, was zu einer Schädigung der Membranen und strukturellen Stützsysteme führen kann. Makromoleküle und gelöste Stoffe werden in einem immer kleiner werdenden Lösungsmittelvolumen zusammengepfercht, was möglicherweise nachteilige Folgen hat. Die Eisbildung in Körperflüssigkeiten birgt auch die Gefahr einer mechanischen Verletzung durch das wachsende Eisgitter, insbesondere in kompakten und stark strukturierten Geweben und Organen. Eisfronten können Gewebe abscheren und trennen und die interzellulären Kommunikationssysteme unterbrechen. Beim Auftauen bilden sich in den extrazellulären Räumen große Ansammlungen von verdünnter Flüssigkeit. Zellvolumen, hydroosmotisches Gleichgewicht und Energiestatus müssen wiederhergestellt werden.

Gefriertoleranzkapazität

Laborstudien haben gezeigt, dass Waldfrösche überleben können: (a) das Einfrieren von bis zu 65-70% ihres Körperwassers; (b) eine Mindestkörpertemperatur von -6°C; und (c) ununterbrochenes Einfrieren für ≥ 4 Wochen. Die Gefriertoleranz variiert jahreszeitlich, da Frösche im Winter am widerstandsfähigsten sind. Solche jahreszeitlichen Schwankungen in der Gefriertoleranz spiegeln möglicherweise teilweise Veränderungen in der Menge des Kälteschutzmittels wider, das produziert werden kann. Das Überleben hängt vom langsamen Einfrieren ab, so dass die Kryoprotektionsmechanismen voll zum Tragen kommen können.

Erholung beim Einfrieren

Die Erholung erfolgt bemerkenswert schnell, wobei die grundlegenden physiologischen und Verhaltensfunktionen in der Regel innerhalb weniger Stunden nach dem Auftauen wiederhergestellt sind (Link zum Video mit geringer Bandbreite/hoher Bandbreite; Link zum NOVA scienceNOW-Beitrag).In Zusammenarbeit mit Jack R. Layne, Jr. (Slippery Rock University) hat unsere Arbeit gezeigt, dass die Dynamik der Wiederherstellung durch die sequentielle Wiederherstellung grundlegender und zunehmend komplexerer Funktionen gekennzeichnet ist. Das Herz zum Beispiel beginnt zu schlagen, noch bevor das Eis im Körper vollständig geschmolzen ist, und die Lungenatmung und der Blutkreislauf werden bald darauf wiederhergestellt. Die Kontraktilität der Hintergliedmaßenmuskeln kehrt 1-2 Stunden nach dem Auftauen zurück, während die Funktion des Ischiasnervs, der die Nerven versorgt, innerhalb von etwa 5 Stunden wiederhergestellt ist. Verhaltensweisen höherer Ordnung, wie der Paarungstrieb und das Balzverhalten, werden erst mehrere Tage später wiederhergestellt (Costanzo et al. 1997).

Gefriertoleranz-Anpassungen

Eine Reaktion, die die Gefriertoleranz bei gefriertoleranten Fröschen fördert, ist die Umverteilung von bis zu 60 % des Wassers, das sich normalerweise in den Geweben befindet. Die Sektion eines gefrorenen Waldfrosches zeigt, dass ein großer Teil des Eises im Lymphsystem und im Coelom gespeichert wird, wo es sich bilden kann, ohne empfindliche Gewebe und Organe zu beschädigen (Lee et al. 1992).

Die Gefriertoleranz wird auch durch die schnelle Synthese von Glukose aus Leberglykogen und die Verteilung dieses Kälteschutzmittels an Zellen im gesamten Körper gefördert. Die angesammelte Glukose verbessert offenbar das Überleben von Zellen, Geweben und Organen, denn wenn man dem Frosch experimentell zusätzliche Glukose verabreicht, erhöht sich seine Toleranz gegenüber dem Einfrieren (Costanzo et al. 1993). Eine der Hauptfunktionen der Glukose besteht darin, den osmotischen Druck der Körperflüssigkeiten zu erhöhen, was wiederum die Menge an Eis, die sich bei einer bestimmten Temperatur bildet, verringert. Glukose, die in die Zellen transportiert wird, wirkt als Osmolyt, wodurch das Ausmaß der Zellschrumpfung beim Einfrieren verringert wird, und dient außerdem als fermentierbarer Brennstoff, der in Abwesenheit von Sauerstoff verstoffwechselt werden kann. Der Waldfrosch verwendet auch Harnstoff als Kälteschutzmittel. Im Gegensatz zu Glukose wird Harnstoff im Herbst und frühen Winter angesammelt und befindet sich bereits in den Zellen, wenn das Einfrieren beginnt. Einiges deutet darauf hin, dass Harnstoff bei der Verhinderung von Kälteschäden wirksamer ist als Glukose (Costanzo und Lee 2005).

Aquaporine (AQPs) und erleichterte Harnstofftransporter (UTs) sind zwei Transporterproteine, denen eine Vielzahl physiologischer Funktionen in verschiedenen Organismen zugeschrieben werden. Kürzlich wurden diese Proteine in einer Reihe von Anuren gefunden; ihre physiologische Bedeutung ist jedoch noch nicht vollständig geklärt. Um die Bedeutung von AQPs und UTs für das Osmolytgleichgewicht bei überwinternden Fröschen zu klären, untersuchen wir die Expression dieser Proteine bei Fröschen mit unterschiedlichem Grad an Terrestrialismus. Außerdem messen wir die jahreszeitlichen Schwankungen der Expression sowie die Veränderungen des Expressionsniveaus als Reaktion auf winterbedingte Stressfaktoren beim Waldfrosch.