In den 1960er Jahren wurden zwei Meilensteine in der Physiologie der intestinalen Zuckerabsorption erreicht. Der erste war die Na+-Glukose-Kotransport-Hypothese von Crane und Kollegen (1), die den aktiven Zuckertransport erklärte, und der zweite war die Entdeckung der Glukose- und Galaktose-Malabsorption (GGM) bei Patienten (5, 6). Die Cotransport-Hypothese wurde eingehend geprüft, bestätigt und auf den “aktiven Transport” einer Vielzahl von Substraten in Zellen ausgedehnt, von der Laktoseanreicherung in Escherichia coli bis zur Jodidanreicherung in der Schilddrüse. Im Wesentlichen handelt es sich bei Cotransportern um molekulare Maschinen, die die in Form von elektrochemischen Ionenpotentialgradienten über die Zellmembranen gespeicherte Energie (Na+ oder H+) nutzen, um die Anreicherung bestimmter gelöster Stoffe und Wasser in den Zellen zu steuern (22). Der intestinale Na+-Glukose-Cotransporter (SGLT1) nutzt Na+ und elektrische Gradienten über die Membran, um Zucker und Wasser entgegen ihrem Konzentrationsgradienten in die Enterozyten zu transportieren (9, 13, 23). Glukose und Galaktose werden beide von SGLT1 transportiert, während Fruktose durch ihren eigenen privaten Träger, den erleichterten Fruktose-Transporter (GLUT5), über die Bürstengrenze transportiert wird. Glukose, Galaktose und Fruktose beenden ihre Reise durch die Zelle ins Blut durch einen anderen erleichterten Zuckertransporter (GLUT2) in der basolateralen Membran (Abb. 1).

GGM ist gekennzeichnet durch einen bei Neugeborenen auftretenden wässrigen und sauren schweren Durchfall, der innerhalb weniger Wochen tödlich verläuft, wenn Laktose (Glukose und Galaktose) nicht aus der Nahrung entfernt wird (2). Der Durchfall hört auf, wenn gefastet wird oder die schädlichen Zucker aus der Nahrung entfernt werden, setzt aber sofort wieder ein, wenn Laktose-, Glukose- oder Galaktose-haltige Nahrung verabreicht wird. Die Fruktoseaufnahme ist nicht beeinträchtigt. In Anbetracht der Krankheitssymptome und der damaligen Erkenntnisse über die intestinale Zuckerabsorption wurde angenommen, dass GGM auf einen Defekt des Na+-Glukose-Cotransporters am Bürstenrand zurückzuführen ist. Diese Hypothese wurde durch die exquisiten autoradiographischen Galaktose-Aufnahme- und Phlorizin-Bindungsexperimente gestützt, die an Schleimhautbiopsien des ersten amerikanischen GGM-Patienten durchgeführt wurden (17, 18). Diese Experimente zeigten, dass die Verringerung des Galaktose-Transports mit einer 90%igen Abnahme der Phlorizin-Bindung an den Bürstenrand einherging. Phlorizin ist ein spezifischer, nicht transportierter, kompetitiver Inhibitor von SGLT1.

Der zuverlässigste diagnostische Test für GGM ist der H2-Atemtest (Abb.2). Die orale Verabreichung von Glukose oder Galaktose (2 g/kg) führt bei Patienten mit GGM zu einem H2-Anstieg in der Atemluft von weit über 20 Teilen/Millionen, während bei Kontrollen oder Patienten, die mit Fruktose gefüttert werden, kein solcher Anstieg zu verzeichnen ist. Kinder mit GGM gedeihen mit Fruktose-Ersatznahrung “normal”, aber die Symptome kehren selbst im Erwachsenenalter mit nur einem Teelöffel Glukose (6 g) zurück, und der H2-Atemtest bleibt positiv. Die Krankheit ist recht selten. Uns sind weltweit etwa 200 Patienten bekannt, und ein hoher Anteil der Fälle stammt aus blutsverwandten Beziehungen.

Die Physiologie und Pathophysiologie der intestinalen Zuckerabsorption wurde 1987 durch die Klonierung des Na+-Glukose-Cotransporters beim Kaninchen mittels einer neuen Strategie, die wir “Expressionsklonierung” nannten, vorangetrieben. Diesem Erfolg folgte schnell die Klonierung des menschlichen Na+-Glukose-Cotransporters durch Turk und Hediger (4) und die Identifizierung der ersten Mutation in einem Transporter, die eine genetische Krankheit, GGM, verursacht, durch Turk et al. (20). Wir erhielten Darmbiopsien von zwei Schwestern, bei denen GGM diagnostiziert wurde, und Blutproben von den Eltern, die Cousins sind. Turk et al. (20) identifizierten eine homozygote Missense-Mutation (Asp28Asn) in der SGLT1-cDNA beider Schwestern, stellten fest, dass jedes Elternteil Träger dieser Mutation war, und wiesen nach, dass die Mutation den Na+-Glukose-Cotransport mit Hilfe eines Oozyten-Expressionstests vollständig aufhob. In derselben Verwandtschaft wurde anschließend ein pränatales Screening an zwei Föten durchgeführt, wobei sich herausstellte, dass eines (das Geschwisterkind des Probanden) Träger der Asp28Asn-Mutation ist und das andere (ein Cousin) normal ist. Beide Kinder gediehen ohne Ernährungseinschränkung und blieben mindestens zwei Jahre lang asymptomatisch (11).

Weitere Fortschritte wurden zunächst durch die Schwierigkeit behindert, Schleimhautbiopsieproben von Kindern mit GGM zu erhalten, bis es Turk et al. (21) gelang, das gesamte menschliche SGLT1-Gen zu kartieren. Das Gen ist groß, mit 15 Exons, die sich auf 72 kb DNA verteilen. Nach der Sequenzierung der Exons und ihrer flankierenden Regionen wurde ein Einzelstrang-Konformations-Polymorphismus-Assay entwickelt, um Patienten mit genomischer DNA aus einer kleinen Blutprobe auf Mutationen zu untersuchen. Diese Entwicklung umfasste die PCR-Amplifikation jedes der 15 Exons und ihrer Intron-Exon-Verbindungen und die Gelelektrophorese der denaturierten PCR-Produkte, um Exons mit Mutationen zu identifizieren. Die anomalen Exons wurden dann sequenziert. Um festzustellen, ob die Mutationen für den Defekt im Zuckertransport verantwortlich sind, wurden die Mutanten in Xenopus laevis-Oozyten für Na+-Glukose-Aufnahmeassays exprimiert. Martı́n (Ref. 10, 12 und unveröffentlichte Beobachtungen) war weitgehend für diese Phase des Projekts verantwortlich. Mutationen, die für die Krankheit verantwortlich sind, wurden bei 33 von 34 untersuchten GGM-Patienten identifiziert. Die Patienten in 17 Verwandtschaftsgruppen trugen homozygote Mutationen, und in weiteren 10 Verwandtschaftsgruppen hatten die Patienten zusammengesetzte heterozygote Mutationen. Dazu gehörten 22 Missense-Mutationen (siehe Abb. 3) sowie 4 Spleißstellen- und 3 Nonsense-Mutationen, die zur Bildung eines stark verkürzten SGLT1-Proteins führen. Dass bei dem 34. Patienten keine Mutationen gefunden wurden, könnte daran liegen, dass die Mutation in der Promotorregion des Gens lag und DNA aus diesem Bereich nicht in das Screening-Verfahren einbezogen wurde.

Als Transportphysiologe habe ich mich für die GGM-Fehlmutationen interessiert, weil sie zur Identifizierung von für den Transport kritischen Resten im Protein beitragen können. Wir haben daher untersucht, wie Missense-Mutationen tatsächlich den Defekt im Na+-Zuckertransport verursachen. Bei diesem Ansatz, der zum großen Teil von Lostao durchgeführt wurde (siehe Referenzen 10 und 12), wurden die mutierten Proteine in X. laevisoocytes exprimiert und dann mit biophysikalischen und biochemischen Methoden der Proteingehalt in der Zelle und in der Plasmamembran bestimmt. In den Fällen, in denen der Transporter in die Plasmamembran eingebaut wurde, haben wir (7) die Teilreaktionen des Transportzyklus untersucht. Zu unserer anfänglichen Enttäuschung mussten wir feststellen, dass bei den ersten 21 untersuchten Missense-Mutanten der primäre Defekt auf ein Mistrafficking der Transporter in der Zelle zurückzuführen war. Anhand von Western Blots wurde festgestellt, dass alle Mutanten in ähnlichem oder höherem Maße synthetisiert wurden als der Wildtyp-SGLT. Ladungsmessungen (7) und Gefrierbruch-Elektronenmikroskopie (24) der Oozyten-Plasmamembran zeigten jedoch, dass die Anzahl der Cotransporter in der Plasmamembran stark reduziert war (10, 12). Nach dem Grad der Kern- und Komplexglykosylierung der Mutanten zu urteilen, trat der Defekt im Transport von SGLT1 zur Plasmamembran entweder zwischen dem endoplasmatischen Retikulum und dem Golgi oder dem Golgi und der Plasmamembran auf. Eine Fehlfaltung der mutierten Proteine kann die Hauptursache für die Fehlsortierung des Transporters sein (19). In nur einem Fall, Gln457Arg, war das mutierte Protein in der Plasmamembran der Eizelle in der Nähe normaler Werte.

Welche Bedeutung haben diese Experimente an Eizellen für den Darm von GGM-Patienten? Um diese Frage zu beantworten, untersuchten wir (unveröffentlichte Daten) die Verteilung des SGLT1-Proteins mittels Immunzytochemie in den Schleimhautbiopsien von drei Patienten mit homozygoten Mutationen. Bei allen dreien war die Verteilung der mutierten Proteine in der Eizelle identisch mit der Verteilung von SGLT1 in den Enterozyten der Patienten: bei zwei befand sich das Protein im Zytoplasma und bei einem im Bürstensaum. Unsere Ergebnisse an den Eizellen stimmen auch mit denen überein, die durch autoradiographische Untersuchungen von Biopsien des ersten amerikanischen GGM-Patienten (18) gewonnen wurden. Stirling und seine Mitarbeiter (18) stellten fest, dass die Bindung von Phlorizin an den Bürstensaum des Patienten um 90 % reduziert war, und wir fanden kein mutiertes SGLT1-Protein (Cys355Ser und Leu147Arg) in der Plasmamembran der Eizellen (10). Diese Studien deuten darauf hin, dass zumindest bei diesen vier GGM-Mutanten die Eizelle das Verhalten des mutierten Proteins im Enterozyten rekapituliert.

Eine wichtige verbleibende Frage ist, wie die über das gesamte Protein verteilten Missense-Mutationen (Abb. 3) den Transport des Transporters zur Plasmamembran stören. Antworten auf diese Frage sind wichtig für das Verständnis der Biosynthese von Plasmamembranproteinen und für die Entwicklung verbesserter Therapien für Kinder mit GGM.

Die GGM-Mutation in einer Verwandtschaft, Gln457Arg, hat unschätzbare Einblicke in den Mechanismus des Zuckertransports geliefert. Lostao untersuchte (in Vorbereitung) das Verhalten von Q457R SGLT1, das in Eizellen und der Darmschleimhaut des Patienten exprimiert wird, und stellte fest, dass das Protein übersetzt, glykosyliert und in die Plasmamembran eingebaut wird, aber nicht in der Lage ist, Zucker zu transportieren. In Abwesenheit von Zucker transportiert das mutierte Protein Na+ über den Na+-Leck- oder Na+-Uniport-Weg, der durch Phlorizin blockiert wird. Glukose ist ebenfalls ein Inhibitor, da sie diesen Na+-Transportweg ebenfalls blockiert, was darauf hindeutet, dass Glukose zwar an Q457R SGLT1 bindet, aber nicht transportiert wird, d. h. die Mutation führt zu einem Defekt der Zuckertranslokation. Panayotova-Heiermann und Kollegen (15) haben unabhängig voneinander gezeigt, dass die Zucker-“Pore” durch SGLT1 von der COOH-terminalen Domäne von SGLT1 gebildet wird, die den Rest Q457 trägt.

Um diese Beobachtungen zu nutzen, haben wir die Rolle von Q457 bei der Zuckertranslokation untersucht. In dieser Studie wurde festgestellt, dass die Cysteinmutante Q457C die volle Na+-Glukose-Transportaktivität beibehält, abgesehen von einem Anstieg der scheinbaren Glukose-Michaelis-Menten-Konstante (Km) von 0,4 auf 6 mM, und die chemische Mutagenese von Q457C mit geladenen oder neutralen Alkylierungsreagenzien (Methanthiosulfonate, MTS) blockiert den Zuckertransport vollständig. Da das alkylierte Q457C-Protein jedoch Glukose mit einer Dissoziationskonstante bindet, die dem scheinbaren Km für den Zuckertransport durch Q457C SGLT1 sehr ähnlich ist, darf dieser Rest nicht Teil der Zucker-Bindungsstelle sein. Die Hemmung des Zuckertransports durch Q457C durch MTS trat nur auf, wenn sich der Cotransporter in der nach außen gerichteten Na+-Konformation, C2, befand (Abb. 4). Das Reagenz war weder in Abwesenheit von Na+ noch in Gegenwart von Na+ und Glucose (oder Phlorizin) noch in Gegenwart von Na+ bei depolarisierten Membranpotentialen wirksam. Spannungssprungexperimente mit rhodaminmarkiertem Q457C zeigten auch, dass der zeitliche Verlauf und die Höhe der Fluoreszenz eng mit dem Übergang des Cotransporters zwischen den Konformationen C2 und C6 einhergingen (Abb. 4). Wir interpretieren diese Ergebnisse dahingehend, dass der Cotransporter in mindestens drei verschiedenen Konformationen (C6, C2 und C3) existieren kann und dass die Kopplung zwischen Na+- und Zuckertransport durch liganden- und spannungsinduzierte Konformationsänderungen im Protein erfolgt.

Vorläufige Studien mit zwei anderen GGM-Fehlmutationen in der COOH-terminalen Domäne von SGLT1, A468V und R499H (Abb. 3), zeigen, dass der Ersatz der Reste durch Cysteine den Transport des Proteins zur Plasmamembran der Eizelle wiederherstellt. Beide Proteine sind funktionsfähig, und der Zuckertransport wird durch MTS-Reagenzien blockiert. Wie im Fall von Q457C sind diese Reste für MTS-Reagenzien nur zugänglich, wenn sich die Proteine in der C2-Konformation befinden. Diese Ergebnisse unterstützen meine Ansicht, dass die Transmembran-Helices 10-13 (Abb. 3) die Zuckerpore bilden. Weitere Arbeiten sind erforderlich, um die Na+-Pore zu identifizieren.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die molekularbiologischen Studien über SGLT1 zur Klonierung der cDNA für das menschliche SGLT1 und zur Kartierung des Gens geführt haben, wodurch leistungsfähige neue Werkzeuge zur Untersuchung der Physiologie des Na+-Glukose-Kotransports und zur Untersuchung von GGM zur Verfügung gestellt wurden. Es wurde bestätigt, dass GGM auf Mutationen im SGLT1-Gen zurückzuführen ist, und die meisten dieser Mutationen führen entweder zu einem verkürzten SGLT1-Protein oder zu einer Fehlleitung des Transporters in der Zelle. Wie bei einer autosomal rezessiven Krankheit zu erwarten, verursacht eine private Mutation die Krankheit in jeder Verwandtschaft, und die Häufigkeit der Krankheit nimmt in Kulturen mit einer hohen Anzahl von Blutsverwandten Ehen zu. Obwohl GGM selten ist, ist es möglich, dass die größere Gruppe von Personen, die leichte SGLT1-Mutationen oder schwere Mutationen auf einem Allel tragen, eine gestörte Glukose- und Galaktoseaufnahme aufweist. Bei etwa 10 % der Normalbevölkerung, d. h. bei Medizinstudenten, wurden positive Glukose-H2-Atemtests durchgeführt (14). Diese Schnittstelle zwischen Physiologie und Krankheit hat nicht nur das Verständnis der Pathophysiologie der Zuckerabsorption verbessert, sondern auch neue Ansätze zur Untersuchung der molekularen Mechanismen der Kopplung zwischen Na+- und Zuckertransport über Plasmamembranen geliefert.

FUSSNOTIZEN

• * Erster in einer Reihe von eingeladenen Artikeln über genetische Störungen des Membrantransports.