ImmunhistochemieBearbeiten
Die Immunhistochemie oder IHC-Färbung von Gewebeschnitten (oder Immunzytochemie, die Färbung von Zellen) ist vielleicht die am häufigsten angewandte Technik der Immunfärbung. Während in den ersten Fällen der IHC-Färbung Fluoreszenzfarbstoffe verwendet wurden (siehe Immunfluoreszenz), werden heute auch andere, nicht fluoreszierende Methoden mit Enzymen wie Peroxidase (siehe Immunoperoxidase-Färbung) und alkalischer Phosphatase eingesetzt. Diese Enzyme sind in der Lage, Reaktionen zu katalysieren, bei denen ein farbiges Produkt entsteht, das mit Hilfe der Lichtmikroskopie leicht zu erkennen ist. Alternativ können radioaktive Elemente als Marker verwendet werden, und die Immunreaktion kann durch Autoradiographie sichtbar gemacht werden.
Die Vorbereitung oder Fixierung des Gewebes ist für die Erhaltung der Zellmorphologie und des Gewebeaufbaus unerlässlich. Eine unsachgemäße oder zu lange Fixierung kann die Bindungsfähigkeit der Antikörper erheblich beeinträchtigen. Viele Antigene können in formalinfixierten, in Paraffin eingebetteten Gewebeschnitten erfolgreich nachgewiesen werden. Einige Antigene überleben jedoch nicht einmal eine mäßige Aldehydfixierung. Unter diesen Bedingungen sollten die Gewebe rasch in flüssigem Stickstoff frisch eingefroren und mit einem Kryostaten geschnitten werden. Zu den Nachteilen gefrorener Schnitte gehören eine schlechte Morphologie, eine schlechte Auflösung bei höheren Vergrößerungen, Schwierigkeiten beim Schneiden von Paraffinschnitten und die Notwendigkeit der Gefrierlagerung. Bei Vibratomschnitten hingegen muss das Gewebe nicht mit organischen Lösungsmitteln oder unter großer Hitze verarbeitet werden, was die Antigenität zerstören kann, oder durch Gefrierauftauen beschädigt werden. Der Nachteil von Vibratomschnitten ist, dass das Schneiden von weichem und schlecht fixiertem Gewebe langsam und schwierig ist und dass in den Schnitten oft Rattermarken oder Vibratomlinien zu sehen sind.
Der Nachweis vieler Antigene kann durch Antigen-Retrieval-Methoden erheblich verbessert werden, bei denen einige der durch die Fixierung gebildeten Proteinvernetzungen aufgebrochen werden, um verborgene antigene Stellen freizulegen. Dies kann durch unterschiedlich langes Erhitzen (heat induced epitope retrieval oder HIER) oder durch Enzymverdau (proteolytic induced epitope retrieval oder PIER) erreicht werden.
Eine der Hauptschwierigkeiten bei der IHC-Färbung ist die Überwindung des spezifischen oder unspezifischen Hintergrunds. Die Optimierung der Fixierungsmethoden und -zeiten, die Vorbehandlung mit Blockierungsmitteln, die Inkubation von Antikörpern mit hohem Salzgehalt und die Optimierung der Waschpuffer und Waschzeiten nach dem Antikörper sind wichtig, um eine qualitativ hochwertige Immunfärbung zu erhalten. Darüber hinaus ist das Vorhandensein von Positiv- und Negativkontrollen für die Färbung wesentlich für die Bestimmung der Spezifität.
DurchflusszytometrieBearbeiten
Ein Durchflusszytometer kann für die direkte Analyse von Zellen verwendet werden, die ein oder mehrere spezifische Proteine exprimieren. Die Zellen werden in Lösung mit ähnlichen Methoden wie bei der Immunfluoreszenz immungefärbt und dann mit Hilfe der Durchflusszytometrie analysiert.
Die Durchflusszytometrie hat gegenüber der IHC mehrere Vorteile, darunter die Möglichkeit, unterschiedliche Zellpopulationen anhand ihrer Größe und Granularität zu definieren, die Fähigkeit, tote Zellen auszusondern, eine höhere Empfindlichkeit und eine Mehrfarbenanalyse zur gleichzeitigen Messung mehrerer Antigene. Allerdings kann die Durchflusszytometrie bei der Erkennung extrem seltener Zellpopulationen weniger effektiv sein, und wenn kein Gewebeschnitt vorliegt, gehen die architektonischen Beziehungen verloren. Die Durchflusszytometrie ist außerdem mit hohen Investitionskosten für die Anschaffung eines Durchflusszytometers verbunden.
Western blottingEdit
Western Blotting ermöglicht den Nachweis spezifischer Proteine aus Zell- oder Gewebeextrakten vor oder nach einer Aufreinigung. Die Proteine werden im Allgemeinen durch Gelelektrophorese nach ihrer Größe aufgetrennt, bevor sie durch trockene, halbtrockene oder nasse Blotting-Methoden auf eine synthetische Membran übertragen werden. Die Membran kann dann mit Antikörpern mit ähnlichen Methoden wie in der Immunhistochemie untersucht werden, ohne dass eine Fixierung erforderlich ist. Der Nachweis erfolgt in der Regel mit Peroxidase-gebundenen Antikörpern, die eine Chemilumineszenzreaktion katalysieren.
Western Blotting ist eine molekularbiologische Routinemethode, die für einen halbquantitativen Vergleich von Proteingehalten zwischen Extrakten verwendet werden kann. Die Größentrennung vor dem Blotting ermöglicht es, das Molekulargewicht des Proteins im Vergleich zu bekannten Molekulargewichtsmarkern zu bestimmen.
Enzyme-linked immunosorbent assayEdit
Der enzyme-linked immunosorbent assay oder ELISA ist eine diagnostische Methode zur quantitativen oder halbquantitativen Bestimmung von Proteinkonzentrationen aus Blutplasma, Serum oder Zell-/Gewebeextrakten in einem Multiwell-Plattenformat (in der Regel 96 Wells pro Platte). Im Allgemeinen werden Proteine in Lösung an ELISA-Platten adsorbiert. Die Platte wird mit Antikörpern, die für das betreffende Protein spezifisch sind, untersucht. Der Hintergrund wird durch Optimierung der Blockierungs- und Waschmethoden (wie bei der IHC) minimiert, und die Spezifität wird durch das Vorhandensein von Positiv- und Negativkontrollen sichergestellt. Die Nachweismethoden sind in der Regel kolorimetrisch oder basieren auf Chemilumineszenz.
Immuno-ElektronenmikroskopieBearbeiten
Mit Hilfe der Elektronenmikroskopie oder EM kann die detaillierte Mikroarchitektur von Geweben oder Zellen untersucht werden. Die Immuno-EM ermöglicht den Nachweis spezifischer Proteine in ultradünnen Gewebeschnitten. Mit Schwermetallpartikeln (z. B. Gold) markierte Antikörper können mit der Transmissionselektronenmikroskopie direkt sichtbar gemacht werden. Die Immuno-EM ist zwar ein leistungsfähiges Verfahren zum Nachweis der subzellulären Lokalisierung eines Proteins, kann aber technisch anspruchsvoll und teuer sein und erfordert eine rigorose Optimierung der Gewebefixierung und der Verarbeitungsmethoden. Die Biotinylierung von Proteinen in vivo wurde vorgeschlagen, um die Probleme zu lösen, die durch die häufige Inkompatibilität der Antikörperfärbung mit Fixierungsprotokollen entstehen, die die Zellmorphologie besser erhalten.