Klinische Implikation

Mikrosatelliteninstabilität (MSI) resultiert aus der systematischen Anhäufung von Deletionen/Insertionen in kurzen repetitiven DNA-Sequenzen in Tumorzellen mit einem mangelhaften Mismatch-Repair-System (MMR). MSI tritt bei etwa 15 % aller kolorektalen Karzinome auf und ist klinisch nützlich, um Patienten mit hereditärem nichtpolypösem kolorektalem Karzinom (HNPCC, Lynch-Syndrom) zu identifizieren, das durch Keimbahnmutationen von MMR-Genen verursacht wird. Der MSI-Status kann auch das Ansprechen bzw. die Resistenz von Krebs auf bestimmte Chemotherapien vorhersagen.

In einem Versuch, die MSI-Analyse zu standardisieren, empfahl ein Workshop des National Cancer Institute (NCI) im Jahr 1997 ein Referenzpanel von fünf Mikrosatellitenmarkern für den Nachweis von MSI und erstellte auf der Grundlage der Ergebnisse MSI-Klassifikationsrichtlinien. Das als Bethesda-Panel bezeichnete Referenzpanel besteht aus zwei Mononukleotid-Loci (Big Adenine Tract oder BAT-25 und BAT-26) und drei Dinukleotid-Loci (D2S123, D5S346 und D17S250). Anhand des Bethesda-Panels wurden Krebsarten mit Instabilität an zwei oder mehr dieser Loci als MSI-hoch (MSI-H) und Krebsarten ohne Instabilität an einem der fünf Loci als Mikrosatelliten-stabil (MSS) eingestuft. Auf einem weiteren Follow-up-Workshop des NCI wurde festgestellt, dass die Sensitivität und Spezifität des ursprünglichen Bethesda-Panels aufgrund der Einbeziehung von Dinukleotid-Wiederholungen, die für die Identifizierung von Krebserkrankungen mit MMR-Defiziten weniger empfindlich und spezifisch sind als Mononukleotid-Wiederholungen, möglicherweise begrenzt sind. Es wurde vorgeschlagen, dass ein Panel von quasimonomorphen Mononukleotid-Wiederholungen empfindlich und spezifisch genug für die Erkennung von Krebsarten mit hohem MSI-Gehalt sein und die Notwendigkeit normaler passender DNA für die getesteten Tumoren überflüssig machen könnte (1-8).

MSI-Analyse-System (Kit nur für Forschungszwecke, Version 1.2, Promega Corporation).

Das MSI-Analyse-System ist ein Multiplex-Assay auf Fluoreszenz-PCR-Basis zum Nachweis von Mikrosatelliteninstabilität. Das MSI Analysis System enthält fluoreszenzmarkierte Primer für die Co-Amplifikation von fünf quasimonomorphen Mononukleotid-Repeat-Markern (BAT-25, BAT-26, NR-21, NR-24 und MONO-27). Die PCR-Produkte werden durch Kapillarelektrophorese (CE) mit einem Applied Biosystems 3500Dx Genetic Analyzer getrennt. Mikrosatelliten-Instabilität an zwei oder mehr Mononukleotid-Loci wird als MSI-hoch interpretiert; Mikrosatelliten-Instabilität an einem einzigen Mononukleotid-Locus oder keine Instabilität an einem der getesteten Loci wird als Mikrosatelliten-stabil (MSS) interpretiert. Typischerweise zeigen MSI-high-Proben Instabilität an allen Loci mit einer durchschnittlichen Abnahme der Produktgröße von 5 bis 9 Basen. Das Vorhandensein von MSI wird mit einer analytischen Spezifität von mindestens 99 % und einer Nachweisgrenze von mindestens 5 % nachgewiesen.

Ein wichtiges Designmerkmal des MSI-Analysesystems ist der Abstand zwischen den fünf verschiedenen Loci, der im Allgemeinen die typische Anzahl der verschobenen Basen (durchschnittlich 5 bis 9 Basen) bei Vorhandensein von MSI übersteigt. Die längste PCR-Amplikongröße beträgt 154 Basenpaare, was für die Analyse von formalinfixiertem, in Paraffin eingebettetem Gewebe (FFPE) vorteilhaft ist.

Dieser Assay ist der Standard für routinemäßige MSI-Tests mit hohem Durchsatz, insbesondere wenn andere nachgeschaltete molekulare Assays für dieselbe DNA-Probe angefordert werden.

Probenanforderungen

Zulässige Proben für den Assay sind formalinfixierte, in Paraffin eingebettete kolorektale Karzinom-Gewebeproben mit einer Fixierungszeit von 6-48 Stunden.

Volumen

Ein repräsentativer Paraffinblock wird bevorzugt. Alternativ sind für Resektionsproben mindestens 5 ungefärbte Gewebeschnitte (5 µm dick) erforderlich.

Lagerungs- und Versandanweisungen

Proben bei Raumtemperatur aufbewahren und versenden.

Einschränkungen

Bei unzureichendem Tumorgehalt ist der Nachweis der MSI-Instabilität möglicherweise nicht möglich: 10 % der Tumorzellen sind erforderlich. Der Tumorinhalt wird vor der Analyse bewertet und eine Makrodissektion durchgeführt. Andere Fixierungsmittel als Formalin oder eine verlängerte Fixierungszeit können zu unzureichenden Ergebnissen führen.

Besondere Anforderungen

Keine.

Durchlaufzeit

Fünf bis sieben Werktage für Objektträger und Paraffinblöcke.

2. IdyllaTM MSI Assay (CE-IVD) – Akkreditierung ausstehend

Der IdyllaTM MSI Assay (RUO) dient dem Nachweis von Mikrosatelliteninstabilität direkt aus formalinfixierten, in Paraffin eingebetteten (FFPE) menschlichen Krebsgewebeschnitten unter Verwendung einer PCR-Reaktion, gefolgt von einer hochauflösenden Schmelzkurvenanalyse auf einem IdyllaTM-Gerät.

Der Assay ermöglicht den Nachweis von Mutationen in 7 monomorphen Homopolymer-Loci zur Identifizierung menschlicher Krebsarten mit Mikrosatelliteninstabilität (ACVR2A, BTBD7, DIDO1, MRE11, RYR3, SEC31A und SULF2). Diese Biomarker sind tumorspezifisch, weisen eine hohe Häufigkeit bei kolorektalen und endometrialen Karzinomen auf und sind über verschiedene Ethnien hinweg stabil. Darüber hinaus erfordern diese tumorspezifischen Biomarker nicht die Analyse gepaarter normaler Gewebeproben.

Der MSI-Status einer Probe wird durch den endgültigen Aufruf aller 7 Biomarker bestimmt. Mikrosatelliteninstabilität an 2 oder mehr Mononukleotid-Loci wird als MSI-hoch interpretiert; Mikrosatelliteninstabilität an einem einzigen Mononukleotid-Locus oder keine Instabilität an einem der getesteten Loci wird als Mikrosatellitenstabilität (MSS) interpretiert.

Dieser Assay ermöglicht MSI-Tests mit geringem Durchsatz und ist ideal für Reflex- oder Rettungstests, um schnell ein genaues MSI-Ergebnis zu erhalten oder zu bestätigen.

Probenanforderungen

Zulässige Proben für den Assay sind in Formalin fixierte, in Paraffin eingebettete kolorektale Karzinom-Gewebeproben mit einer Fixierungszeit von 6-48 Stunden.

Volumen

Ein repräsentativer Paraffinblock wird bevorzugt. Alternativ sind für Resektionsproben mindestens 2 ungefärbte Gewebeschnitte (5 µm dick; 50-600 mm²) erforderlich.

Lagerungs- und Versandanweisungen

Proben bei Raumtemperatur aufbewahren und versenden.

Einschränkungen

Bei unzureichendem Tumorgehalt ist der Nachweis der MSI-Instabilität möglicherweise nicht möglich: 20 % der Tumorzellen sind erforderlich. Der Tumorinhalt wird vor der Analyse bewertet und eine Makrodissektion durchgeführt. Andere Fixierungsmittel als Formalin oder eine verlängerte Fixierungszeit können zu unzureichenden Ergebnissen führen.

Besondere Anforderungen

Keine.

Durchlaufzeit

Drei bis fünf Arbeitstage für Objektträger bzw. Paraffinblöcke.

1. Umar A, Boland CR, Terdiman JP et al. Revised Bethesda Guidelines for Hereditary Nonpolyposis Colorectal cancer (Lynch Syndrome) and Microsatellite Instability. Journal of the National Cancer Institute 2004;96(4):261-268.
2. De la Chapelle A, Hampel H. Clinical Relevance of Microsatellite Instability in Colorectal Cancer. Journal of Clinical Oncology 2010;28(20):3380-3387.
3. Bacher JW, Flanagan LA, Smalley RL et al. Development of a fluorescent multiplex assay for detection of MSI-High tumors. Disease Markers 2004; 20:237-250.
4. Murphy KM, Zhang S, Geiger T et al. Comparison of the Microsatellite Instability Analysis System and the Bethesda Panel for the Determination of Microsatellite Instability in Colorectal Cancers. Journal of Molecular Diagnostics 2006;8(3):305-311.
5. Anderson S, Bloom KJ, Vallera DU et al. Multisite Analytic Performance Studies of a Real-Time Polymerase Chain Reaction Assay for the Detection of BRAF V600E Mutations in Formalin-fixed Paraffin-Embedded Tissue Specimens of Malignant Melanoma. Arch Pathol Lab Med 2012;136(11):1385-1391.
6. Buhard O, Suraweera N, Lectard A et al. Quasimonomorphe Mononukleotidwiederholungen für die Analyse der Mikrosatelliteninstabilität auf hohem Niveau. Disease Markers 2004;20:251-257.
7. Patil DT, Bronner MP, Portier BP et al. A five-marker panel in a multiplex PCR accurately detects microsatellite instability-high colorectal tumors without control DNA. Diagn Mol Pathol 2012 Sep;21(3):127-33.
8. Berg KD, Glaser CL, Thompson RE et al. Detection of microsatellite instability by fluorescence mulitplex polymerase chain reaction. J Mol Diagn 2000, 2:20-28.
9. De Craene et al. Detection of microsatellite instability (MSI) in colorectal cancer samples with a novel set of highly sensitive markers by means of the IdyllaTM MSI Test prototype. Journal of Clinical Oncology 2018; 36:15.

Aktualisiert am 23. Mai 2019