Diskussion

Die menschliche Mikrobiota umfasst mehr als tausend verschiedene Bakterienarten und spielt eine wichtige Rolle für die menschliche Gesundheit, indem sie die Nährstoffversorgung fördert, die Besiedlung mit Krankheitserregern verhindert und die normale Immunität der Schleimhäute formt und aufrechterhält. Innerhalb dieses großen Pools von Bakterien wird probiotischen Nahrungsergänzungsmitteln, die LAB (d. h. Laktobazillen und Bifidobakterien) enthalten, eine Reihe positiver Auswirkungen auf die menschliche Gesundheit zugeschrieben, wie z. B. die Vorbeugung von Durchfall und entzündlichen Darmerkrankungen oder die Prophylaxe urogenitaler Infektionen. Unser Wissen über die biochemische Rolle, die bestimmte Arten und Stämme bei der menschlichen Gesundheit und Krankheit spielen, ist jedoch sehr begrenzt. In dieser Studie wollten wir das Verständnis der Nitratreduktionswege in ausgewählten häufigen Bakterienarten, die den menschlichen Darm besiedeln, verbessern, indem wir In-vitro-Bedingungen verwendeten, die mit nitratreichen Diäten und dem Sauerstoffgehalt an den Schleimhautoberflächen des GI-Trakts kompatibel sind. Die wichtigsten Ergebnisse unserer Untersuchung zeigen, dass: 1) E.coli, ein fakultativer Anaerobier, wandelt Nitrat in Nitrit und anschließend in Ammoniak um, das sich nach und nach in den Kulturmedien anreichert; 2) L.plantarum, ein fermentatives Bakterium, das in Gegenwart von exogenem Häm und Vitamin K2 gezüchtet wird, führt ähnliche Prozesse durch; 3) die Enzyme von E.coli erzeugen nur unter anaeroben Bedingungen signifikantes NO aus Nitrit; 4) alle untersuchten LAB-Kulturen erzeugen große Mengen an Milchsäure, was zu einer ausreichenden Ansäuerung der Kulturmedien führt, um die Disproportionierung von Nitrit zu NO zu fördern.

Die meisten Eukaryoten gewinnen ihre Energie in erster Linie durch oxidative Phosphorylierung und müssen für die Bildung von ATP O2 einatmen. Viele Darmbakterien, darunter auch E.coli K12-Stämme, können jedoch NO3- als alternativen Elektronenakzeptor verwenden, wenn O2 begrenzt und Nitrat reichlich vorhanden ist. E. coli ist das Modellmitglied der Enterobacteriaceae, und obwohl diese Familie nur einen kleinen Teil der Darmmikrobiota ausmacht, ist sie besonders wichtig, da bestimmte Stämme Krankheiten verursachen können. Kürzlich wurde auch gezeigt, dass Nitrat, das als Nebenprodukt einer Entzündung des Wirts erzeugt wird, von E. coli während der Atmung genutzt werden kann, um einen Wachstumsvorteil zu erzielen und die im Dickdarm ansässigen Mikroben, die nur auf Fermentation angewiesen sind, zu verdrängen. L. plantarum gilt als sicheres Probiotikum und kommt häufig im Darmtrakt von Säugetieren sowie im menschlichen Speichel vor, wo sich Nitrate aufgrund des entero-salivären Nitratkreislaufs, der etwa 25 % des gesamten zirkulierenden Nitrats ausmacht, bekanntermaßen in millimolaren Mengen anreichern. Dieses Bakterium weist den für die LAB-Familie typischen fakultativ heterofermentativen Stoffwechselweg auf, doch wurden kürzlich im Genom von L. plantarum WCFS1 Gene identifiziert, die für ein mutmaßliches Nitrat-Reduktionssystem (narGHJI) kodieren, was darauf schließen lässt, dass es Nitrat als Elektronenakzeptor nutzen kann. In der Tat hat eine kürzlich veröffentlichte genetische Analyse von L. plantarum seine enorme Vielfalt und vielseitige Stoffwechselfähigkeit hervorgehoben.

In unseren Experimenten wurde sowohl in E. coli als auch in L. plantarum eine signifikante Nitratreduktaseaktivität festgestellt, wenn die Sauerstoffspannung von atmosphärischem Niveau gegen Null sinkt. Im Gegensatz dazu zeigte B. longum infantis, ein mikroklima-toleranter Anaerobier aus dem Magen-Darm-Trakt von Säuglingen, selbst bei hohen Konzentrationen keine Fähigkeit zur Nitratreduktion. Bifidobakterien machen bis zu 90 % der Bakterien im Magen-Darm-Trakt eines Säuglings aus, und unsere Ergebnisse stimmen mit der Beobachtung überein, dass die menschliche Muttermilch, die besonders hohe Nitritwerte aufweist, eine Nahrungsquelle für Nitrit darstellt, bevor sich die zur Nitratreduktion fähige Zungen- und Darmmikrobiota etabliert, die normalerweise in der Erwachsenenflora zu finden ist.

In Abb. 1 haben wir gezeigt, dass E.coli-Kulturen, die 5 mM NO3- enthielten, einen Wachstumsvorteil gegenüber Kulturen ohne Nitratzusatz hatten, und dann haben wir die Wirkung von Sauerstoff- und Nitratgradienten auf die Produktion von Nitrit und Ammoniak bestimmt. Unsere Ergebnisse zeigen, dass etwa 2,5 mM NO3- bei entweder 4 % oder weniger O2 ausreichen, um die Expression von Nitratreduktase-Enzymen zu induzieren, und dass sich nach 24 Stunden eine beträchtliche Menge Nitrit sowohl in den E.coli-Zellen als auch im Kulturmedium anreichert. Eine detaillierte molekulare Analyse der Regulierung der bakteriellen Enzymaktivitäten würde den Rahmen dieser Studie sprengen. Es ist jedoch bekannt, dass E.coli K12-Stämme drei molybdänhaltige Nitratreduktasen exprimieren und dass Wolfram diese Enzyme deaktivieren kann, indem es das Molybdänatom am aktiven Zentrum ersetzt. Wir stellten fest, dass die Zugabe von 300 μM Wolframoxid zu Kulturen, die wie in den in Abb. 1 dargestellten Experimenten gezüchtet wurden, die Bildung von Nitrit fast vollständig aufhob (Daten nicht gezeigt). Daher glauben wir, dass molybdänabhängige Nitratreduktasen für den entscheidenden Schritt bei der Bildung von Nitrit verantwortlich sind. Es ist auch wichtig zu erwähnen, dass E.coli, wie auch viele andere Bakterienarten, aufgrund der Bildung von Metall-Nitrosyl-Komplexen anfällig für Nitrittoxizität sind und diese Toxizität durch die koordinierte Induktion eines Nitritmembrantransporters und anderer Enzyme, die die Nitritreduktion vermitteln, minimieren. Eine vollständige Beschreibung der E.coli-Nitrat- und Nitrit-Reduktase-Enzyme sowie der Regulierung und Expression der Operone findet sich in den ausgezeichneten Veröffentlichungen von Stewart und Cole.

Stickstoffoxid-Reduktionswege im menschlichen Darm

Das Vorhandensein von Nitrat und Nitrit im unteren Magen-Darm-Trakt hängt von zahlreichen Aspekten ab, unter anderem von den Arten der Bakterien, die den Darm besiedeln, und dem komplizierten Gleichgewicht zwischen der Ernährung und den Stickstoffoxid-Stoffwechselwegen. Es ist jedoch seit langem bekannt, dass die endogene Nitratproduktion aus der NO-Oxidation (hauptsächlich durch Reaktion mit Oxyhämoglobin) um eine Größenordnung höher ist als die Nahrungsaufnahme, wie in den späten 1970er Jahren und in jüngerer Zeit in Studien mit eNOS-defizienten Mäusen gezeigt wurde. In der schematischen Darstellung in Abb. 5 haben wir die Verbindung zwischen der bakteriellen respiratorischen Denitrifikation, der Reduktion von Stickoxiden zu Ammoniak, dem endogenen L-Arginin/NO-Synthaseweg und der nicht-enzymatischen Nitritreduktion zu NO zusammengefasst. Bei der Denitrifikation (roter Kasten) wird Nitrat in einem vierstufigen Prozess zu Stickstoffgas (N2) reduziert, wobei Nitrit, NO und Distickstoffoxid als Elektronenakzeptoren in energieerzeugenden Reaktionen dienen. Kürzlich wurde ein vollständiger Denitrifikationsweg, der zur Produktion von N2 führt, in menschlichem Zahnbelag nachgewiesen, und obwohl er beim Menschen immer noch als unbedeutend angesehen wird, spekulieren wir, dass er bei sehr niedriger Sauerstoffspannung in Gegenwart von Nitrat eine wichtige Rolle spielen könnte und die Bildung von N2 im menschlichen Darm nicht ausgeschlossen werden kann. Denitrifikation und dissimilatorische Nitratreduktion zu Ammoniak (DNRA, blauer Kasten) haben den ersten Schritt der Nitrat-zu-Nitrit-Reduktion gemeinsam, und mehrere Klassen von Nitratreduktasen wurden mit dieser Reaktion in Verbindung gebracht. Bei DNRA ist der zweite Schritt die direkte Reduktion von Nitrit zu Ammoniak mit sechs Elektronen, die keine Energie liefert, aber ein ziemlich häufiger Entgiftungsprozess in fakultativ anaeroben Bakterien ist. Es wurde vermutet, dass DNRA der Hauptweg des Nitratstoffwechsels im Pansen von Säugetieren ist. In dieser Studie wurde Ammoniak als ein Produkt der Nitratreduktion in E.coli und Lactobacilli-Bakterien identifiziert, die in Gegenwart von mM Nitrat bei 4 % Sauerstoff oder niedrigeren Werten gezüchtet wurden.

Erweitern

Respiratorische Denitrifikation kann ebenfalls kleine, aber relevante Mengen von NO als Zwischenprodukt erzeugen und wurde in die bakterielle NO-Produktion im Darm einbezogen. Andere mögliche Wege zur NO-Bildung sind die saure Umwandlung von Nitrit (grüner Kasten) und die Oxidation von L-Arginin durch NOS-Enzyme (brauner Kreis). In Abb. 4C haben wir die Protonenabhängigkeit der nicht-enzymatischen Disproportionierung von Nitrit untersucht und gezeigt, dass sie nur dann relevant wird, wenn der intrazelluläre pH-Wert oder der pH-Wert der Körperflüssigkeiten niedriger als 5,5 ist. Unsere Ergebnisse schlossen auch das Vorhandensein aktiver NOS-Enzyme in E. coli und L. plantarum aus, obwohl bekannt ist, dass Darmepithelzellen durch Expression sowohl der endothelialen als auch der induzierbaren NOS-Isoformen NO produzieren. Interessanterweise könnte die NO-Produktion im Darm auch durch die enzymatischen Prozesse der Peroxidasen ausgelöst werden, die auf den Zellen der Darmschleimhaut reichlich vorhanden sind und nachweislich Nitrit als Substrat verwenden, um NO als Teil ihrer antibakteriellen Wirkung zu produzieren.

Wir glauben, dass alle diese verschiedenen Nitratreduktionswege nebeneinander bestehen und gleichzeitig auftreten können, obwohl es wahrscheinlich ist, dass nur ein Metabolit je nach den spezifischen physiologischen Bedingungen vorherrscht.

Physiologische Bedeutung der NO-Bildung durch bakterielle Nitratreduktion

Nahrungsnitrat und Nitrit werden in vielen Studien immer noch als mögliche toxische Substanzen dargestellt, obwohl es immer mehr Beweise dafür gibt, dass die NO-Produktion aus diesen Ionen wichtige positive Auswirkungen auf kardiovaskuläre, immunologische und gastrointestinale Funktionen hat. Im Darm erfüllt NO mehrere physiologische Funktionen wie die Regulierung der Schleimhautdurchblutung, der Darmbeweglichkeit und der Schleimdicke. Die chronische Überproduktion von NO wurde auch mit entzündlichen Darmerkrankungen in Verbindung gebracht und hemmt wahrscheinlich das Wachstum einer Vielzahl von Bakterienarten. Frühere Studien ließen unklar, wie Darmbakterien NO produzieren, Sobko et al. zeigten jedoch, dass im Gegensatz zu konventionellen Ratten die NO-Konzentrationen im Darm von keimfreien Ratten extrem niedrig sind und dass die beobachtete NO-Produktion um das Zehnfache anstieg, wenn sie mit einer normalen Bakterienflora geimpft wurden.

In unseren Experimenten bestimmten Sauerstoff- und Protonenkonzentrationen den spezifischen Weg der Nitratreduktion zu NO. Die in Abb. 4A dargestellten Ergebnisse deuten darauf hin, dass E.coli unter anaeroben Bedingungen mit Nitratkonzentrationen von mehr als 1 mM zu enzymatischer NO-Aktivität fähig ist, möglicherweise über Denitrifikation oder das periplasmatische Cytochrom c-Nitritreduktase-Enzym (Nrf), wie von Corker und Poole vorgeschlagen. Diese NO-Bildung ist jedoch bei 2 % Sauerstoff stark reduziert und wird unabhängig von Nitrat. Wichtig ist, dass unsere Daten mit dem Bericht von Sobko und Kollegen übereinstimmen, wonach E. coli während einer 24-stündigen Inkubation mit 0,1 mM Nitrat nur unbedeutende NO-Mengen erzeugt. LAB produzierte beträchtliche Mengen an NO als Reaktion auf die Ansäuerung des Mediums aufgrund der Akkumulation von Milchsäure. Das Ersetzen des Wachstumsmediums durch frisches LMRS (pH = 6,5) blockierte die Fähigkeit der LAB-Kulturen, Nitrit in NO umzuwandeln, fast vollständig, nicht jedoch bei E.coli. Messungen des pH-Wertes im Darm liegen zwischen 5,7 und 7,5, so dass die Nitrit-Disproportionierung in vivo wahrscheinlich ein geringer und lokal begrenzter Aspekt der NO-Produktion ist. Umgekehrt ist dieser Weg ein gut bekanntes Phänomen im sauren Milieu des Magens (pH-Wert etwa 3).

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass das von Darmbakterien in der Nähe der Darmschleimhaut erzeugte NO entweder die oben genannten positiven Wirkungen ausüben oder bei höheren Werten diese Funktionen beeinträchtigen kann. Somit kann die bakterielle NO-Bildung im Darm als Modulator sowohl physiologischer als auch pathologischer Wirkungen angesehen werden.

Physiologische Auswirkungen der bakteriellen Ammoniakbildung auf die Gesundheit

Seit den bahnbrechenden Studien von Vince et al. in den frühen 1970er Jahren ist bekannt, dass Kolonbakterien Ammoniak durch Aminosäuredesaminierung oder durch Urease, die Hydrolyse von Harnstoff in Kohlendioxid und Ammoniak, produzieren. In jüngerer Zeit berichteten Cole und Kollegen, dass das Hauptprodukt der Nitritreduktion in E. coli Ammoniak ist, wobei bei neutralem pH-Wert nur etwa 1 % zu NO reduziert wird. Die Ergebnisse unserer Studie deuten darauf hin, dass zumindest einige häufige Darmbakterien Nitrit hauptsächlich zu Ammoniak und nicht zu NO reduzieren. Bei gesunden Menschen wird unter normalen physiologischen Bedingungen der Großteil des im unteren Magen-Darm-Trakt gebildeten Ammoniaks mit den Körperflüssigkeiten ausgeschieden und von den Leberhepatozyten verstoffwechselt, wo Ammoniak und Kohlendioxid enzymatisch in Carbamoylphosphat umgewandelt werden, das in die als “Harnstoffzyklus” bezeichnete Reaktionsreihe eingeht, die zur Bildung von Harnstoff und dessen Ausscheidung durch die Niere führt (siehe Abb. 5). Die normale Plasmakonzentration von Ammoniak liegt im Bereich von 10-35 μM, doch wenn die Ammoniakproduktion übermäßig hoch ist, kann das Ammoniak im Pfortaderblut die Leber umgehen und zu einer Hyperammonämie führen. Ammoniak im Blut durchdringt ungehindert die Blut-Hirn-Schranke, und hohe Konzentrationen (>100 μM) haben toxische Auswirkungen auf das zentrale Nervensystem und führen zu Enzephalopathie und schließlich zum Koma. Patienten mit Leberzirrhose entwickeln sehr häufig eine hepatische Enzephalopathie (HE). Liegt kein Leberversagen vor, wurde das hyperammonämische Koma auf eine Sepsis durch Urease-fähige Mikroorganismen wie Klebsiella pneumonia zurückgeführt. Zu den klassischen therapeutischen Ansätzen für HE gehören die Senkung des systemischen Ammoniakspiegels durch eine Antibiotikabehandlung (zur Abtötung der ammoniakproduzierenden Darmbakterien) und die Verabreichung von nicht resorbierbaren Zuckern wie Lactulose und Lactitol . Im Dickdarm wird Laktulose durch die Wirkung von Dickdarmbakterien vor allem zu Milchsäure, aber auch zu geringen Mengen von Ameisen- und Essigsäure abgebaut. Diese Ansäuerung begünstigt die Bildung des nicht resorbierbaren Ammoniumions aus Ammoniak und verringert dessen Konzentration im Plasma. Es ist unklar, in welchem Maße Nahrungsnitrat zur Ammoniakkonzentration im Darm und im Blut beiträgt, wir schlagen jedoch die alternative Hypothese vor, dass die verstärkte Ansäuerung des Dickdarminhalts aufgrund des Vorhandenseins von Laktulose die Mikrobiota bei der Umwandlung von Nitrit in NO anstelle von Ammoniak durch den bekannten säureabhängigen Mechanismus begünstigt.

Schlussfolgerungen

Über 30 Jahre lang konnte das biologische Schicksal von exogenem Nitrat nicht in den ausgeschiedenen stickstoffhaltigen Verbindungen berücksichtigt werden, die etwa 60 % einer eingenommenen Nitratdosis beim Menschen ausmachen. Unsere Ergebnisse unterstützen die Idee, dass Nitrat durch Bakterien im Speichel, Magen, Dünn- und Dickdarm in Nitrit und dann in andere reduzierte Stickstoff-Biomoleküle wie NO, Ammoniak, Harnstoff und möglicherweise Stickstoffgas umgewandelt wird. Die Frage, wie viel Ammoniak aus der Nitrat-Nitrit-Reduktion im Vergleich zu anderen wichtigen Prozessen wie der Desaminierung und der bakteriellen Urease-Aktivität entsteht, erfordert detaillierte Stoffwechselstudien an Tieren und/oder Menschen. Die biologische Bedeutung der Umwandlung von Nitraten aus der Nahrung im Darmlumen ist noch nicht geklärt. Die traditionelle japanische und mediterrane Ernährung, die bekanntermaßen eine schützende Wirkung auf das Herz-Kreislauf-System hat, weist jedoch eine durchschnittliche Nitrataufnahme pro Person auf, die zwei- bis dreimal höher ist als die typische westliche Ernährung (in den Vereinigten Staaten entspricht dies etwa 40-100 mg/Tag Nitrat). Weitere Untersuchungen über die Verbindung zwischen symbiotischen Bakterien, dem Stickoxid-Stoffwechsel und der menschlichen Gesundheit sind erforderlich; es ist jedoch klar, dass die biologischen Wege des Stickstoff-Stoffwechsels bei Säugetieren komplexer und wichtiger sind, als man sich noch vor einigen Jahren vorstellen konnte.