ERGEBNISSE UND DISKUSSION
Eine A375-Melanomzelllinie mit einer konstitutiv aktivierten MAPK aufgrund einer BRAFV600E-Mutation wurde 8 Stunden lang mit dem MEK-Inhibitor U0126 in einer Konzentration von 25 μM behandelt, was zu einer Unterdrückung der ERK-Phosphorylierung führte (Abb. 1 a). Die mRNAs der immunsuppressiven löslichen Faktoren, einschließlich IL-6, IL-10 und VEGF, nahmen durch die U0126-Behandlung deutlich ab (Abb. 1 b), während die DMSO-Kontrollbehandlung keinen Einfluss auf die Produktion der IL-10- und VEGF-mRNAs hatte und den Spiegel der IL-6-mRNA nur leicht erhöhte. Eine 18-stündige Exposition mit U0126 unterdrückte auch die Produktion von IL-10, VEGF und IL-6 auf Proteinebene, was darauf hindeutet, dass aktivierte ERKs für die Unterdrückung lokaler Immunantworten gegen das Melanom durch die Produktion dieser immunsuppressiven Faktoren verantwortlich sein könnten (Abb. 1 c). Darüber hinaus traten die Unterdrückung der ERK-Phosphorylierung und die Hemmung der IL-6-, IL-10- und VEGF-Produktion auch nach Reduzierung der U0126-Behandlungskonzentration auf 10 μM auf (nicht dargestellt). In dieser Studie wurden bei der U0126-Behandlung der A375-Zellen keine signifikanten zytotoxischen Wirkungen beobachtet. Obwohl bekannt ist, dass U0126 neben MEK1/2 auch MEK5 hemmt, wurde phosphoryliertes ERK5, das MEK5-Substrat, in den A375-Zellen nicht nachgewiesen (nicht abgebildet), was darauf hindeutet, dass der MEK1/2-ERK1/2-Weg für die bei der U0126-Behandlung beobachteten Effekte verantwortlich ist. Die unterdrückende Wirkung von U0126 auf die IL-10- und VEGF-Produktion wurde auch bei drei anderen Melanomzelllinien mit der BRAFV600E-Mutation, 624mel, 888mel und 928mel, nachgewiesen, ohne dass eine signifikante zelluläre Toxizität auftrat (Abb. 1 d). Da diese Melanomzelllinien kein IL-6 produzieren, scheint die aktivierte MAPK-Signalisierung eine allgemeine Rolle bei der Produktion der immunsuppressiven Faktoren IL-10 und VEGF in BRAFV600E+ Melanomzelllinien zu spielen.
Reduzierte Produktion der immunsuppressiven löslichen Faktoren IL-6, IL-10 und VEGF von Melanomzelllinien mit konstitutiv aktiver MAPK durch die BRAFV600E-Mutation durch Hemmung der MAPK-Signalübertragung mit einem MEK-Inhibitor, U0126. (a) Die Hemmung der Phosphorylierung von ERK1/2 wurde durch Western-Blot-Analyse der Melanomzelllinie A375mel mit der BRAFV600E-Mutation vor und 2, 4, 6 und 8 Stunden nach Behandlung mit dem MEK-Inhibitor U0126 in einer Konzentration von 25 μM nachgewiesen. (b) Hemmung der mRNA-Expression für immunsuppressive lösliche Faktoren IL-6, IL-10 und VEGF in A375-Zellen. Die mRNAs für verschiedene lösliche Faktoren, einschließlich IL-6, IL-10 und VEGF, wurden durch quantitative RT-PCR vor und 2, 4, 6 und 8 Stunden nach der Behandlung mit U0126 gemessen. Die Kontrollbehandlung wurde mit einer DMSO-Lösung durchgeführt. Die mRNA-Spiegel zu jedem Zeitpunkt wurden auf die GAPDH-mRNA normalisiert und als relativer Wert zu dem von 0 h angegeben. (c) Verminderte Produktion von IL-6-, IL-10- und VEGF-Proteinen aus A375-Zellen nach einer 18-stündigen Behandlung mit U0126 in einer Konzentration von 25 μM. Die Expression wurde mittels ELISA mit den Kulturüberständen nachgewiesen. Das Verhältnis der Lebensfähigkeit von U0126-behandelten Zellen zu DMSO-behandelten Zellen bei der Ernte betrug 77 %. Die Zytokinproduktion wurde auf der Grundlage der Zellzahl auf den Wert der mit DMSO behandelten Kontrollzellen normiert. Der Western Blot zeigte eine starke Hemmung der ERK-Phosphorylierung, aber nicht des STAT3-Proteins oder seiner Phosphorylierung an Ser727 und Tyr705. (d) Verminderte Produktion von IL-10 und VEGF aus drei Melanomzelllinien mit der BRAFV600E-Mutation, 624mel, 888mel und 928mel, nach einer 18-stündigen Behandlung mit U0126 in einer Konzentration von 25 μM, die mittels ELISA mit den Kulturüberständen nachgewiesen wurde. Das Verhältnis der Lebensfähigkeit von U0126-behandelten Zellen zu DMSO-behandelten Zellen bei der Ernte betrug 95 % für 624mel, 103 % für 888mel und 100 % für 928mel. Die Zytokinproduktion wurde auf der Grundlage der Zellzahl auf den Wert der mit DMSO behandelten Kontrollzellen normiert. Der Western Blot zeigte eine starke Hemmung der ERK-Phosphorylierung, aber nicht des STAT3-Proteins. Ein leichter Rückgang der Ser727-Phosphorylierung von STAT3 wurde in 888mel- und 928mel-Zellen, nicht jedoch in 624mel-Zellen beobachtet. Diese Ergebnisse sind repräsentativ für drei oder vier unabhängige Experimente mit ähnlichen Resultaten.
Aufgrund der beobachteten leichten Abnahme der STAT3-Phosphorylierung an Ser727 in 888mel und 928mel (Abb. 1 d) können unspezifische Wirkungen von U0126 auf die Zytokinproduktion über andere Wege als den MAPK-Signalweg bei diesen Experimenten jedoch nicht vollständig ausgeschlossen werden. Um die Rolle der durch die BRAFV600E-Mutation aktivierten MAPK bei der Produktion von IL-10, VEGF und IL-6 zu bestätigen, wurde BRAFV600E-spezifisches RNAi in drei Melanomzelllinien, A375, 888mel und 624mel, unter Verwendung des Lentivirus, der BRAFV600E-spezifische Kurzhaar-RNA (shRNA) exprimiert, transfiziert (11). Die BRAFV600E-spezifische RNAi hemmte signifikant die IL-10-, VEGF- und IL-6-Produktion und unterdrückte die ERK-Phosphorylierung (Abb. 2). Diese Ergebnisse bestätigen, dass die Hemmung dieser Faktoren durch U0126 (Abb. 1) mit der spezifischen Hemmung des MAPK-Signalwegs korreliert ist. Diese Ergebnisse stehen im Einklang mit neueren Arbeiten, die eine ERK1/2-induzierte IL-10-Produktion in murinen Makrophagen (12) und eine BRAFV600E-abhängige VEGF-Produktion zur Förderung der Angiogenese (13) zeigen.
Reduzierte Produktion der immunsuppressiven Faktoren IL-6, IL-10 und VEGF von drei Melanomzelllinien mit der BRAFV600E-Mutation durch BRAFV600E-spezifisches RNAi. Die drei Melanom-Zelllinien mit der BRAFV600E-Mutation, A375mel, 888mel und 624mel, wurden mit Lentivirus-Vektoren infiziert, die für Kurzhaarnadel-RNA für entweder Glühwürmchen-Luciferase-mRNA (GL3B; als Kontrolle) oder BRAFV600E-mRNA (BRAF#1′) bei einer 50- oder 100-fachen Infektionsdichte kodieren. 5 oder 6 Tage nach der Infektion wurden die Proteine extrahiert und einer Western-Blot-Analyse unterzogen. Durch das BRAFV600E-spezifische RNAi wurde eine deutliche Abnahme der ERK1/2-Phosphorylierung mit einer Abnahme des BRAF-Proteins beobachtet. Es wurde kein signifikanter Unterschied beim STAT3-Protein und der Phosphorylierung von STAT3 an Ser727 oder Tyr705 festgestellt. Ein leichter Rückgang der Phosphorylierung an Ser727 wurde in 888mel- und 624mel-Zellen nach BRAF-RNAi beobachtet. 5 oder 6 Tage nach der Lentivirus-Infektion wurde die gleiche Anzahl von Melanomzellen in einer Dichte von 1-2 × 106 Zellen/2 ml verteilt, und die Kulturüberstände wurden nach 18 Stunden im ELISA auf IL-6, IL-10 oder VEGF untersucht. Es wurde ein deutlicher Rückgang von IL-6, IL-10 und VEGF beobachtet. Ein repräsentatives Ergebnis von zwei oder drei unabhängigen Experimenten mit ähnlichen Ergebnissen wird gezeigt.
Da festgestellt wurde, dass die aktivierte STAT3-Signalübertragung durch die Produktion verschiedener Faktoren, einschließlich VEGF (8, 9), zu einer Immunevasion von Krebs führt, untersuchten wir die Beziehung zwischen den MAPK- und STAT3-Signalwegen in Bezug auf die Produktion von immunsuppressiven Faktoren in der A375-Melanomzelllinie. Die Produktion von IL-6, IL-10 und VEGF wurde durch RNAi, das entweder nur auf BRAFV600E oder nur auf STAT3 abzielte, stark gehemmt (Abb. 3 a). Bei gleichzeitiger Einschränkung der BRAF-MAPK- und STAT3-Signalwege wurde kein eindeutiger additiver oder synergistischer Effekt beobachtet (Abb. 3 a). BRAFV600E RNAi in den A375-Zellen verringerte weder die STAT3-DNA-Bindungsaktivität (Abb. 3 b) noch die STAT3-Promotoraktivität (Abb. 3 c) oder die STAT3-Phosphorylierung an Ser727 oder Tyr705 (Abb. 2), obwohl berichtet wurde, dass ERKs potenziell in der Lage sein könnten, STAT3 an Ser727 zu phosphorylieren (14). Die STAT3-Phosphorylierung kann jedoch auch über einen ERK-unabhängigen Weg erfolgen (15). In 624mel-Zellen kam es zwar zu einem leichten Rückgang von Ser727-phosphoryliertem STAT3, aber die DNA-Bindungsaktivität (Abb. 3 b) und die STAT3-Promotoraktivität (Abb. 3 c) wurden durch das BRAFV600E-RNAi nicht beeinträchtigt (Abb. 2). In 888mel-Zellen kam es zu einem ähnlichen Rückgang der Ser727-Phosphorylierung, aber umgekehrt nahmen sowohl die DNA-Bindungsaktivität von STAT3 (Abb. 3 b) als auch die STAT3-Promotoraktivität (Abb. 3 c) nach dem BRAFV600E-RNAi ab (Abb. 2). Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Verringerung der STAT3-Transkriptionsaktivität nicht der Hauptmechanismus ist, der die Unterdrückung des immunsuppressiven Faktors durch die Herunterregulierung der MAPK-Signalübertragung in diesen Melanomzelllinien bewirkt.
Hemmung der IL-6-, IL-10- und VEGF-Produktion in A375-Zellen durch RNAi für BRAFV600E allein, STAT3 allein oder beides, ohne signifikante Veränderungen der DNA-Bindungs- und Promotoraktivität von STAT3. (a) Tiefgreifende Hemmung der IL-6-, IL-10- und VEGF-Produktion in A375 durch RNAi für BRAFV600E allein, STAT3 allein oder beides. 5 oder 6 Tage nach der Infektion wurde die gleiche Anzahl von Zellen in einer Dichte von 106 Zellen/2 ml verteilt, und der Kulturüberstand wurde nach 18 Stunden einem ELISA-Test für IL-6, VEGF und IL-10 unterzogen. Die Verringerung von BRAF und phosphoryliertem ERK1/2 durch das BRAFV600E-spezifische RNAi und die Verringerung von STAT3 durch das STAT3-spezifische RNAi wurden durch Western-Blot-Analyse bestätigt. Abgebildet ist ein repräsentatives Ergebnis von sechs unabhängigen Experimenten mit ähnlichen Resultaten. (b) Keine signifikante Veränderung der STAT3-DNA-Bindungsaktivität durch die Hemmung der MAPK-Signalübertragung mit BRAF-RNAi in Melanom-Zelllinien. Die STAT3-DNA-Bindungsaktivität wurde durch EMSA der Kernextrakte von Melanomzelllinien mit GL3B-Kontrolle oder BRAF#1′ shRNA-Vektorbehandlung untersucht. Die durch Pfeile gekennzeichneten spezifischen STAT3-Banden verschwanden mit der kalten Wildtyp-STAT3-DNA-Sonde (wt), nicht aber mit der mutierten STAT3-DNA-Sonde (mt). In 888mel-Zellen wurde nur eine leichte Abnahme der STAT3-DNA-Bindungsaktivität beobachtet. (c) STAT3-Reporter-Assays in A375-, 624mel- und 888mel-Zellen. 2-4 × 105 Zellen mit entweder Kontrolle oder BRAF#1′ shRNA-Vektor-Infektion wurden mit 0,4 μg pSTAT3-TA-Luc und 0,4 μg pRL-SV40 mit Effectene Transfection Reagent transfiziert. 24 Stunden nach der Transfektion wurden die Zellen geerntet und auf Glühwürmchen- und Renilla-Luciferase-Aktivität untersucht. Jede Firefly-Luciferase-Aktivität wurde mit der Renilla-Luciferase-Aktivität normalisiert. Die schattierten Balken und die Fehlerbalken geben den Mittelwert bzw. die Standardabweichung der dreifachen Versuche an. Abgebildet ist ein repräsentatives Experiment aus drei oder vier unabhängigen Versuchen. Die STAT3-gesteuerte Transkription wurde nach dem BRAF-RNAi in A375 und 624mel nicht verändert, nahm aber in 888mel leicht ab.
Als Nächstes wurden die potenziellen Auswirkungen der löslichen Faktoren, die durch die MAPK- und STAT3-Signalübertragung im Überstand der A375-Kulturen auf die Reifung der DCs induziert werden, untersucht. Der Überstand der kultivierten A375-Melanomzellen enthält lösliche Faktoren, die die Reifung von aus menschlichen Monozyten gewonnenen DCs (MoDCs) hemmen, wenn diese mit Toll-like-Rezeptor-Liganden wie LPS stimuliert werden. Die Zugabe von A375-Kulturüberständen zu MoDC-Kulturen in einer Endkonzentration von 10-20 % verringerte signifikant die Produktion entzündlicher Zytokine, einschließlich IL-12 und TNF-α, in MoDCs sowie die zellulären Oberflächenmoleküle CD1a und CD83, aber nicht CD80, CD86, CD40 oder HLA-DR auf MoDCs. Supernatantien der anderen drei Melanomzelllinien führten zu den gleichen Ergebnissen, wenn sie den MoDC-Kulturen zugesetzt wurden (nicht abgebildet). Die suppressive Aktivität der Melanomzellüberstände ist auf die Produktion von IL-6, IL-10 und VEGF zurückzuführen, da die Zugabe von spezifischen Antikörpern für diese Faktoren die suppressive Aktivität der A375-Kulturüberstände verringerte (Abb. 4 a). Die Unterschiede zwischen unseren Beobachtungen und den zuvor berichteten Ergebnissen bezüglich des Überstands von B16-Mausmelanomzellen mit aktiviertem STAT3, der die Expression von MHC-Klasse II und CD40 hemmt, können durch unterschiedliche Tumorzellen oder Spezies erklärt werden (8).
Verringerte suppressive Aktivität der A375-Melanom-Kulturüberstände durch Vorbehandlung mit RNAi für BRAFV600E allein, STAT3 allein oder beide auf die LPS-induzierte IL-12- und TNF-α-Produktion von DCs. (a) Die Neutralisierung von IL-6, IL-10 oder VEGF in den Kulturüberständen von A375-Melanomzellen stellte die Hemmung der IL-12-Produktion von LPS-stimulierten menschlichen DCs wieder her. Humane MoDCs wurden mit den A375-Überständen in Gegenwart oder Abwesenheit des monoklonalen Antikörpers für IL-6, IL-10, VEGF oder eines Isotyp-Kontroll-Antikörpers bei 1 μg/ml kultiviert. Die IL-12-Produktion in den Kulturüberständen wurde 24 Stunden nach der LPS-Stimulation mit 100 ng/ml mittels ELISA bestimmt. (b) CD14+ Monozyten wurden mittels MACS aus PBMCs isoliert und in Medien kultiviert, die RPMI 1640, 10 % (Vol./Vol.) FBS, 100 ng/ml GM-CSF und 50 ng/ml IL-4 mit oder ohne 20 % (Vol./Vol.) des Kulturüberstands der in Abb. 3 hergestellten A375mel-Zellen enthalten. (a) Die Hälfte der Medien, Zytokine und des Kulturüberstands wurde alle 2 Tage gewechselt. Am Tag 5 der Kultur wurde LPS in einer Konzentration von 100 ng/ml zugegeben. Nach 15 Stunden wurden die Kulturüberstände gesammelt und im ELISA auf IL-12 und TNF-α untersucht.
Die unterdrückende Wirkung der A375-Kulturüberstände auf die IL-12- und TNF-α-Produktion der LPS-behandelten MoDCs wurde durch Vorbehandlung der A375-Zellen mit RNAi, das entweder nur BRAFV600E, nur STAT3 oder sowohl BRAFV600E als auch STAT3 anspricht, wiederhergestellt (Abb. 4 b). Obwohl das STAT3-RNAi die suppressive Aktivität der A375-Kulturüberstände stärker zu reduzieren schien als das BRAFV600E-RNAi, könnte der Unterschied einfach auf unterschiedliche RNAi-Aktivitäten zurückzuführen sein. Es ist jedoch wichtig festzustellen, dass keine additiven und synergistischen Effekte durch die RNAi, die gleichzeitig auf BRAF und STAT3 abzielen, beobachtet wurden; auch dies ist ein Hinweis auf die wesentliche Rolle beider Signalwege bei der Produktion von suppressiven Faktoren für die DC-Reifung. Obwohl eine Aktivierung von DCs durch den Überstand der murinen CT26-Kolonkarzinom-Zelllinie, die mit einer dominant-negativen Form von STAT3 transfiziert wurde, möglicherweise durch die erhöhte Produktion von proinflammatorischen Zytokinen berichtet wurde, wurde in dieser Studie keine Aktivierung von DCs beobachtet. Dies könnte durch eine unvollständige Hemmung von BRAF und STAT3, keine erhöhte Produktion proinflammatorischer Zytokine in den BRAF shRNA-transfizierten Melanomzellen oder durch Unterschiede in den Tumorzellen oder Spezies erklärt werden.
Zusammenfassend haben wir zum ersten Mal eine wesentliche Rolle der MAPK-Signalübertragung zusammen mit dem STAT3-Signalweg für die Produktion verschiedener immunsuppressiver Faktoren in Melanomzelllinien mit konstitutiv aktiver MAPK aufgrund der gemeinsamen BRAFV600E-Mutation nachgewiesen. Somit könnte der MAPK-Signalweg ein potenziell bedeutendes molekulares Ziel für die Überwindung der Immunevasion verschiedener Krebsarten sein, da er bei verschiedenen Krebsarten, einschließlich Melanomen ohne BRAFV600E-Mutation, häufig aktiviert ist (16, 17).