Mathis begann im Alter von 16 Jahren mit der Schauspielerei. Ihr erster Job war ein Werbespot für “Always Slender Pads – Just For Teens”. Von 1988 bis 1989 spielte sie in den Fernsehserien “Aaron’s Way” und “Knightwatch” eine Nebenrolle. Ihre erste Hauptrolle in einem Spielfilm war die der Nora in Pump Up the Volume (1990), an der Seite von Christian Slater, mit dem sie zu dieser Zeit kurzzeitig zusammen war. Für die Rolle färbte Mathis ihr naturblondes Haar schwarz, um ihr Image von süß und unschuldig zu einem starken Willen zu verändern.
Mathis trat 1990 in den Fernsehfilmen Extreme Close-up, 83 Hours ’til Dawn und To My Daughter auf. Mathis und Slater hatten Sprachrollen in dem Zeichentrickfilm FernGully: The Last Rainforest (1992). Als nächstes spielte sie in der Komödie This Is My Life (1992), geschrieben und inszeniert von Nora Ephron, einen unsicheren Teenager. Im Oktober 1992 trat Mathis in dem Theaterstück Fortinbras in New York City auf. Super Mario Bros. (1993), in dem sie die Prinzessin Daisy aus dem beliebten Nintendo-Videospiel spielte, war ein Kassenschlager, erlangte aber seit seiner Veröffentlichung Kultstatus.
Mathis lernte den Schauspieler River Phoenix am Set von The Thing Called Love (1993) kennen und die beiden begannen eine Beziehung. Sie war mit Phoenix am 31. Oktober 1993 zusammen, in der Nacht, in der er im Cedars-Sinai Hospital an einer Überdosis Drogen starb, nachdem er vor dem Viper Room in West Hollywood zusammengebrochen war. Sie drehte den Film Jack and Sarah (1995), der in London gedreht wurde, um nach seinem Tod wegen der übermäßigen Presseberichterstattung das Land zu verlassen.
Mathis spielte 1994 in der Verfilmung von Little Women und in How to Make an American Quilt (1995), beide mit Winona Ryder in der Hauptrolle. Anschließend spielte sie in The American President (1995) die Assistentin des Präsidenten der Vereinigten Staaten. In John Woos Broken Arrow (1996) spielte Mathis neben John Travolta erneut mit Christian Slater zusammen. Nach dem Tod ihrer Mutter, die 1996 an Brustkrebs erkrankte, nahm sie sich etwas mehr als ein Jahr Auszeit von der Schauspielerei.
Mathis spielte später in American Psycho (2000), einer Verfilmung des gleichnamigen Romans von Bret Easton Ellis aus dem Jahr 1991. Sie spielte die Hauptrolle in Attraction (2000) und in The Simian Line (2001). Sie spielte die Hauptrolle in der TNT-Miniserie The Mists of Avalon (2001). Mathis spielte die Hauptrolle mit Thomas Jane in The Punisher (2004). Sie hatte eine Gastrolle in der ABC-Fernsehserie Lost als Olivia Goodspeed. Sie spielte die Tochter von Jane Fonda in der Broadway-Show “33 Variations”. Ihr Indie-Film Lebanon, PA hatte seine Weltpremiere auf dem SXSW Film Festival 2010. Im Oktober 2011 spielte sie in einer Off-Broadway-Produktion des Stücks Love, Loss, and What I Wore am New York City’s Westside Theatre.
Im Jahr 2013 spielte Mathis die Psychiaterin Alice Calvert in der CBS-Fernsehserie Under the Dome, die auf einem Roman von Stephen King basiert. 2014 schloss sie sich der Besetzung der FX-Horror-Dramaserie The Strain als Justine Feraldo an, einer New Yorker Stadträtin für Staten Island.
Im Jahr 2019 trat Mathis Off-Broadway in der Rolle der Kate Conlee in Make Believe auf, einem neuen Stück von Bess Wohl, das am Second Stage Theater aufgeführt wurde. Michael Greif führte Regie.
Ihr für 2020 geplantes Musical, Whisper House, wurde aufgrund der COVID-19-Pandemie verschoben.