3.1 Endogene Fischenzyme
Wie bereits erwähnt, finden sich verschiedene proteolytische Enzyme in den Eingeweiden, im Verdauungstrakt und im Muskelgewebe der Fische.
Die wichtigsten endogenen Proteinasen in Sardellen waren trypsinartige Proteinase, Pepsin, Chymotrypsin, Elastase und Aminopeptidase (Martinez & Serra, 1989; Siringan, Raksakulthai, & Yongsawatdigul, 2006). Die Verdauungsenzyme Trypsin, Chymotrypsin und Pepsin werden als die drei wichtigsten Enzyme im Vergleich zu anderen angesehen (de la Parra, Rosas, Lazo, & Viana, 2007). Pepsin findet sich normalerweise im Magen von Fischen und ist ein Hauptenzym der Verdauungssäfte (de la Parra et al., 2007). Trypsin ist in Eingeweiden, Pyloruscaeca und Milz vorhanden (Kishimura, Hayashi, Miyashita, & Nonami, 2005, 2006; Kishimura et al., 2007; Klomklao et al., 2006). Das Hepatopankreas der Verdauungsorgane von Fischen und Schalentieren enthält sowohl Peptidase- als auch Proteinase-Aktivitäten wie Aminopeptidase, gelatinolytische Proteasen, Trypsin und Chymotrypsin sowie kollagenolytische Proteasen (Sriket, 2014).
Es wurde festgestellt, dass die meisten Lipolyse- und Proteolyse-Aktivitäten bei der Peda-Verarbeitung im Darm verzeichnet wurden, insbesondere zu Beginn des Fermentationsprozesses; die Aktivitäten nahmen jedoch während des Prozesses schnell ab (Irianto, 1990). Da sich die Enzyme in den Eingeweiden und im Verdauungstrakt befinden, spielt das Ausweiden eine wichtige Rolle bei der Bestimmung der Geschwindigkeit und der Art des enzymatischen Abbaus, der stattfindet. Fermentierte Fischprodukte, die unter Verwendung des ganzen Fisches verarbeitet werden, haben andere Eigenschaften als solche, die aus geköpftem und ausgenommenem Fisch hergestellt werden (Wheaton & Lawson, 1985). Die enzymatische Aktivität der meisten viszeralen und Verdauungstrakt-Enzyme von Fischen war bei nahezu neutralen pH-Werten am größten (Bougatef et al., 2007; Munilla-Moran & Saborido-Rey, 1996).
Castillo-Yañez, Pacheco-Aguilar, Garcia-Carreño und Toro (2004) isolierten ein saures proteolytisches Enzym, das zur Klasse der Asparagin-Proteasen gehört, aus den Eingeweiden von Sardinen. Das Enzym ähnelt dem Pepsin II aus anderen Fischarten und ist bei pH 3-6 und 45°C stabil.
Die Pyloruscaeca sind die Organe, die die Hauptquelle für alkalische Proteinasen sind. Ein Trypsin-ähnliches Enzym, das aus den Pyloruscaeca von Kabeljau (G. morhua) gewonnen wurde, hatte einen isoelektrischen Punkt von 5,30 und 5,89 und war in der Aminosäurezusammensetzung dem Rinder-Trypsin sehr ähnlich, unterschied sich aber durch einen höheren relativen Anteil an sauren Aminosäuren und einen geringeren Anteil an basischen Aminosäuren. Das Enzym hydrolysierte auch Fischproteinsubstrate (Beirão, Mackie, Teixeira, & Damian, 2001).
Drei alkalische Proteinasen und zwei saure Proteinasen wurden aus Sardinen isoliert. Jede der alkalischen Proteinasen hydrolysierte Kasein schneller als andere Proteine. Eine große alkalische Proteinase (III) hydrolysierte sarkoplasmatische Proteine aus Sardinen fünfmal schneller als andere alkalische Proteinasen. Jede von zwei sauren Proteinasen hydrolysierte Hämoglobin und Myoglobin schneller als die anderen Proteine. Nach Vorinkubation mit 25 % NaCl waren eine alkalische Proteinase (III) und eine saure Proteinase (II) stabil, während die anderen Proteinasen instabil wurden. Die beiden Proteinasen, die alkalische Proteinase III und die saure Proteinase II, waren auch noch 3 Monate nach Beginn der Fischsaucenherstellung stabil. Die proteolytische Aktivität jeder der alkalischen und sauren Proteinasen wurde durch mehr als 15 % NaCl stark gehemmt; eine minimale Hemmung wurde jedoch beobachtet, wenn Sardinenmuskelproteine als Substrat verwendet wurden (Noda, Van, Kusakabe, & Murakami, 1982).
Zwei Aminopeptidasen (I und II) wurden aus entfetteten inneren Organen von Sardinen extrahiert und durch DEAE-Cellulose-Chromatographie, Gelfiltration auf Sephadex G-200 und isoelektrische Fokussierung gereinigt. Die Endpräparate der Enzyme I und II wurden durch Polyacrylamid-Gelelektrophorese als nahezu homogen beurteilt. Die Molekulargewichte der Enzyme I und II wurden durch Gelfiltration auf 370.000 bzw. 320.000 bestimmt. Die isoelektrischen Punkte lagen bei 4,1 (I) bzw. 4,8 (II). Beide Enzyme wurden durch EDTA gehemmt und durch Co++ aktiviert. Bestatin konnte Enzym I hemmen, nicht aber Enzym II. Die Enzyme I und II hydrolysierten nicht nur synthetische Substrate, die Alanin oder Leucin enthielten, sondern auch Di-, Tri- und Tetra-Alanin schnell. Aufgrund all dieser Merkmale ähneln die Sardinen-Aminopeptidasen der menschlichen Alanin-Aminopeptidase. Enzym I behielt mehr als 70 % seiner ursprünglichen Aktivität in 15 % NaCl, was darauf hindeutet, dass das Enzym an der Hydrolyse von Fischproteinen und Peptiden bei der Herstellung von Fischsauce beteiligt ist (Vo Van, Kusakabe, & Murakami, 1983).
Die Aktivitäten der alkalischen und sauren Proteinasen wurden mit Rinder-Trypsin und Pepsin verglichen und zeigten, dass die alkalische Proteinase aus dem Pyloruscaeca der Sardinen wie das Rinder-Trypsin das Kasein effektiver hydrolysierte als andere Proteinsubstrate (Noda et al., 1982).
Enzyme des Muskelgewebes, insbesondere Kathepsine, Peptidasen, Transaminasen, Amidasen, Aminosäure-Decarboxylasen, Glutamat-Dehydrogenasen und verwandte Enzyme, sind alle im Fischmuskelgewebe zu finden (Chaveesuk, 1991), und diese Enzyme, insbesondere Trypsin, Chymotrypsin und Kathepsin, sind an der Proteinhydrolyse während der Fischsaucenfermentation beteiligt (Fernandes, 2016). Die Enzyme des Muskelgewebes befinden sich hauptsächlich in den Zellen. Verdauungsenzyme hingegen sind exozelluläre Sekrete. Obwohl einige Studien gezeigt haben, dass die Enzyme des Muskelgewebes bei neutralem pH-Wert eine optimale Aktivität aufweisen, wird in den meisten Berichten darauf hingewiesen, dass niedrige pH-Werte die Aktivitäten der Enzyme des Muskelgewebes beschleunigen. Die meisten fermentierten Fischprodukte werden bei einem pH-Wert über 4 verarbeitet, mit Ausnahme von Fischsilage und einigen fermentierten Fischprodukten. Dementsprechend befinden sich die meisten Enzyme des Muskelgewebes nicht im optimalen pH-Bereich (Mackie et al., 1971).
Die teilweise Charakterisierung der Kathepsine B aus dem Stöcker-Muskel wies auf ähnliche Eigenschaften wie andere Kathepsine BS hin. Der optimale pH-Wert des Kathepsins lag bei 5 und die optimale Temperatur bei 50°C. Die Aktivität wurde durch E-64, CA-074 und Chymostatin gehemmt (Yoshida et al., 2015).
Maximale Enzymaktivitäten können durch die Verwendung von ganzen Fischen einschließlich Köpfen und Eingeweiden erreicht werden. Im Gegensatz dazu wird eine minimale Enzymaktivität erreicht, wenn entköpfter und ausgenommener Fisch zur Herstellung fermentierter Fischprodukte verwendet wird. Zwischenzeitlich kann eine mittlere Enzymaktivität erreicht werden, wenn die Eingeweide jederzeit nach dem Fang entfernt werden, um eine gewisse Diffusion der viszeralen Enzyme in das Gewebe zu ermöglichen (Owens & Mendoza, 1985).
Bei gesalzenem Fisch wird die Reifung durch drei Hypothesen beschrieben. Diese sind (1) die mikrobiologische Theorie, (2) die autolytische Theorie und (3) die Enzymtheorie. Nach der mikrobiologischen Theorie produzieren die Mikroorganismen die wesentlichen aktiven Enzyme, die in das Fleisch eindringen und zum Reifungsprozess beitragen. Die autolytische Theorie beschreibt, dass die Reifung auf die Aktivität von Enzymen der Muskeln oder anderer Gewebe oder des Magen-Darm-Trakts zurückzuführen ist. Die Enzymtheorie schließlich erklärt, dass die Reifung von gesalzenem Fisch unter dem Einfluss bestimmter Enzyme stattfindet, nämlich derjenigen, die im Muskelgewebe enthalten sind, derjenigen, die sich in den Darmorganen des Fisches befinden, sowie derjenigen, die von Mikroorganismen produziert werden (Mackie et al., 1971).
Bei der Reifung von Sardellen wurde die maximale autolytische Aktivität der Indischen Sardelle (Stolephorus indicus) bei 60°C festgestellt. Die autolytische Aktivität nahm mit steigender NaCl-Konzentration ab. Der Rohextrakt wies einen optimalen pH-Wert von 8,5-9,5 auf. Trypsin-ähnliche Proteinasen waren die vorherrschenden Proteinasen im Rohextrakt. Proteinasen aus indischen Sardellen könnten an der Proteinhydrolyse während der Fermentation von Fischsauce beteiligt sein. Daher könnte die Inkubation von indischen Sardellen bei 60 °C und in 10 % NaCl über einen bestimmten Zeitraum vor dem vollständigen Einsalzen mit 25 % NaCl eine wirksame Methode zur Beschleunigung des Fermentationsprozesses von Fischsauce sein (Siringan et al., 2006).