Das allgemeine Ziel dieses Verfahrens ist die sequentielle Extraktion von RNA und DNA aus archivierten, in Formalin fixierten, in Paraffin eingebetteten Gewebekernen. Dies ist ein Protokoll zur Entnahme von Gewebekernen, aus denen wir sowohl RNA als auch DNA extrahieren werden. Der Hauptvorteil dieses Protokolls besteht darin, dass es die RNA- und DNA-Ausbeute aus genau definierten Regionen im Gewebeblock verbessert.

Dieses Verfahren wurde weitgehend an archivierten Prostatakrebsgeweben entwickelt. Es kann auch auf andere Arten von Archivgeweben angewendet werden. Die visuelle Demonstration dieser Methode ist von entscheidender Bedeutung, da das Entkernen des Gewebes in Forschungslabors nicht üblich ist.

Die meisten Forschungslabors verwenden stattdessen Querschnitte, die das Gewebe schneller erschöpfen und der Probe eine erhebliche Heterogenität verleihen. Beginnen Sie mit der Durchsicht des Objektträgers und markieren Sie die zu untersuchende Region mit einem feinen Permanentmarker. Schneiden Sie dann ein Stück Paraffinfolie aus, das groß genug ist, um den interessierenden Bereich auf dem Objektträger abzudecken.

Legen Sie dann die Folie fest auf den Objektträger und wickeln Sie die Folie über die Ränder, damit sie nicht verrutscht. Umreißen Sie mit einem feinen Permanentmarker das gesamte Gewebe und den interessierenden Bereich im Gewebe. Nehmen Sie dann den Film vom Objektträger und übertragen Sie ihn auf den entsprechenden Gewebeblock.

Richten Sie den Film durch Drehen oder Wenden so aus, dass der Umriss des gesamten Gewebes mit der beobachteten Form des Gewebes im Block übereinstimmt. Drücken Sie den Folienabschnitt fest auf die Oberfläche des Blocks, um ein Verrutschen zu verhindern. Machen Sie mit der Spitze des Permanentmarkers flache, aber sichtbare Einkerbungen entlang des Umrisses der zu untersuchenden Region und entfernen Sie dann die Folie.

Als Nächstes reinigen Sie die Aufnahmestanze aus dem 0,6-Millimeter-Stanzset, indem Sie die Spitze in ein 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen mit einem Milliliter Bleichmittel tauchen und die Stanze mehrmals auf und ab bewegen. Wiederholen Sie den Waschvorgang mit dem Röhrchen, das 70-prozentiges Ethanol enthält, und dann mit Wasser. Drücken Sie nun den gereinigten Stempel bis zu einer Tiefe von drei Millimetern in die zu untersuchende Region und ziehen Sie ihn zurück.

Lösen Sie den Kern in ein Mikrozentrifugenröhrchen mit geringer Bindung, indem Sie ihn mit dem Stift aus dem Stempel herausdrücken. Geben Sie einen Milliliter Xylol in die Mikrozentrifugenröhrchen mit den Gewebekernen und schütteln Sie zehn Sekunden lang kräftig. Dann drei Minuten lang in einen auf 50 Grad Celsius eingestellten Wärmeblock legen.

Nach der Inkubation zwei Minuten lang bei Raumtemperatur bei maximaler Geschwindigkeit zentrifugieren. Nach der Zentrifugation legen Sie die Kerne fünf Minuten lang auf Eis, damit sich der wachsartige Rückstand verfestigt. Entfernen Sie nun vorsichtig das Paraffin, das sich um den Meniskus herum angesammelt hat, zusammen mit dem Überstand mit einer Pipettenspitze.

Dann wiederholen Sie die Xylol-Behandlung. Nach dem Entfernen des Paraffin-Xylol-Gemischs fügen Sie einen Milliliter 100-prozentiges Ethanol hinzu und schütteln zehn Sekunden lang kräftig. Nach dem Zentrifugieren bei maximaler Geschwindigkeit für zwei Minuten das Ethanol vorsichtig verwerfen.

Die Ethanolwäsche noch einmal wiederholen, bevor mit der Homogenisierung begonnen wird. Resuspendieren Sie die entparaffinierten Kerne vor der Homogenisierung in 700 Mikrolitern 100-prozentigem Ethanol. Verwenden Sie einen motorisierten Gewebehomogenisator auf mittlerer Stufe, um die Kerne zu feinen Partikeln zu zerkleinern.

Die gründliche Homogenisierung der Gewebekerne ist für eine optimale DNA- und RNA-Ausbeute erforderlich. Füllen Sie anschließend separate 15-Milliliter-Röhrchen mit etwa zehn Millilitern Bleichmittel, RNase-Neutralisierungslösung und 70 Prozent Ethanol. Nach der Probenhomogenisierung waschen Sie die Homogenisatorsonde der Reihe nach in jeder der Reinigungslösungen.

Lassen Sie den Homogenisator während der Waschphase auf höchster Stufe laufen. Wischen Sie die Sonde mit einem Papiertuch ab und lassen Sie die Sonde vollständig trocknen, bevor Sie die nächste Probe homogenisieren. Führen Sie eine Sichtprüfung der Sondenblätter auf Gewebereste durch und reinigen Sie die Sonde gegebenenfalls erneut.

Nach der Homogenisierung bringen Sie das Probenvolumen mit 100-prozentigem Ethanol auf einen Milliliter und zentrifugieren Sie dann 15 Minuten lang bei maximaler Drehzahl. Saugen Sie das Ethanol vorsichtig ab und lassen Sie die Pellets etwa 15 bis 20 Minuten an der Luft trocknen, bevor Sie mit der Proteinase-K-Extraktion beginnen. Resuspendieren Sie die Pellets in 150 Mikroliter Proteinase-K-Verdauungspuffer und schwenken Sie die Röhrchen, um das Pellet zu lösen.

Für eine höhere DNA-Gewinnung wird ein Proteinase-K-Verdau über Nacht empfohlen. 10 Mikroliter temperaturstabile Proteinase K zugeben und durch Schütteln mischen. Inkubieren Sie bei 56 Grad Celsius für 15 Minuten unter leichtem Schütteln.

Inkubieren Sie die Röhrchen für drei Minuten auf Eis. Nach dem Abkühlen zentrifugieren Sie das Röhrchen 15 Minuten lang bei maximaler Geschwindigkeit. Anschließend überführen Sie den Überstand vorsichtig in ein neues Mikrozentrifugenröhrchen für die RNA-Reinigung, ohne die Pellets zu stören.

Extrahieren Sie RNA und DNA nach dem optimierten Verfahren des schriftlichen Protokolls, das eine verlängerte Gewebeaufschlusszeit für die DNA-Extraktion vorsieht. Mit dieser Methode können RNA und DNA aus älteren formalinfixierten, in Paraffin eingebetteten Gewebeproben gewonnen werden. Nukleinsäuren wurden aus Prostatakrebs-Proben mit einem Alter von drei bis 14 Jahren mitextrahiert.

Die durchschnittliche Ausbeute betrug 2.270 Nanogramm RNA und 820 Nanogramm DNA. Interessanterweise gab es keine signifikante Korrelation zwischen dem Alter der Gewebeprobe und der Nukleinsäureausbeute. Insgesamt korrelierten die RNA- und DNA-Ausbeuten bei allen Proben, obwohl in den meisten Fällen mehr als doppelt so viel RNA wie DNA gewonnen wurde.

Um die Leistungsfähigkeit der mit diesem Protokoll extrahierten genomischen DNA zu demonstrieren, wurden Bisulfit-konvertierte DNA-Extrakte aus archivierten Prostatakrebsproben durch methylierungsspezifische PCR amplifiziert. ALU-Repetitive Elemente wurden als Methylierungskontrolle verwendet und wiesen nur geringe Unterschiede zwischen den Proben auf. GSTP1, ein Gen, von dem bekannt ist, dass es bei Prostatakrebs hyper-methyliert ist, zeigte keine nachweisbare Amplifikation durch methylierungsspezifische PCR, wenn DNA aus gutartigen Proben verwendet wurde.

DNA-Proben von Patienten mit aggressivem Prostatakrebs wiesen nachweisbare QPCR-Zyklus-Schwellenwerte auf, die niedriger waren als die von indolenten Prostatakrebszellen, was auf eine erhöhte Methylierung von GSTP1 bei aggressivem Prostatakrebs hinweist. Wenn diese Technik einmal beherrscht wird, kann sie für RNA innerhalb von drei bis vier Stunden und für DNA nach einem Verdau über Nacht innerhalb von vier Stunden durchgeführt werden, wenn sie richtig ausgeführt wird. Diese Technik sollte es Forschern in der Molekularpathologie ermöglichen, diagnostische DNA- und RNA-Biomarker bei einer Vielzahl von Krebsarten zu erforschen.

Nach dem Ansehen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Gewebekerne für die Extraktion von DNA und RNA aus genau kartierten Bereichen von Interesse in archivierten Gewebeblöcken vorbereitet.