Dr. Bang interessierte sich sehr für die Kreislaufsysteme von Wirbeltieren. Er glaubte, dass das Studium von Tieren, bei denen der Kreislauf beobachtet werden kann, zu einem besseren Verständnis der physiologischen Prozesse bei Wirbeltieren, wie z. B. dem Menschen, führen würde.
In den frühen 1950er Jahren, als er am Marine Biological Laboratory in Wood’s Hole, Maine, tätig war, untersuchte Bang das Kreislaufsystem des Hufeisenkrebses und seine Reaktion auf eine bakterielle Infektion.
Er injizierte Hufeisenkrebsen unterschiedlicher Größe Bakterien aus frischem Meerwasser und untersuchte ihre Reaktion. Normalerweise bildete das Blut ein kleines Gerinnsel, um den infizierten Bereich abzudichten und das Eindringen weiterer Bakterien zu verhindern.
Aber eines Tages bemerkte Bang, dass eine seiner Krabben an einer unbekannten Infektion starb, die dazu führte, dass fast das gesamte Blutvolumen der Krabbe zu einer halbfesten Masse geronnen war.
Das hatte man noch nie zuvor gesehen!
So isolierte und züchtete er das Bakterium von dem ersten Tier und injizierte es anderen Hufeisenkrabben. Auch bei ihnen trat die gleiche Gerinnung auf und sie starben.
Bei weiteren Untersuchungen stellte er fest, dass nur “gramnegative” Bakterien diese Reaktion hervorrufen.
Note: In 1884, Hans Christian Gram invented a staining procedure for microscopy which came to be called The Gram stain. It stains the bacteria either red (Gram-negative) or violet (Gram-positive) depending on the chemicals they have in their cell walls.
Gramnegative Bakterien verursachen Infektionen wie Lungenentzündung und Meningitis. Als Bang die Bakterien vor der Injektion hitzeabtötete, erhielt er immer noch die gleiche Gerinnungsreaktion. Das bedeutete, dass keine lebenden Bakterien erforderlich waren, um das Blut des Hufeisenkrebses zur Gerinnung zu bringen.
Er veröffentlichte seine Ergebnisse 1956 und legte seine anfänglichen Beobachtungen für fast 10 Jahre beiseite.
Jack Levin tritt ein.
Im Jahr 1963, als Bang die Daten seines Hufeisenkrebsprojekts besprach, schlug ein Kollege vor, dass die Zusammenarbeit mit einem Hämatologen helfen könnte, das Geheimnis der Blutgerinnung zu lüften. Der Kollege empfahl einen Forschungsmitarbeiter aus seinem Labor, Dr. Jack Levin.
Levin untersuchte an Kaninchen die Shwartzman-Reaktion – die Reaktion auf Endotoxine, die zur Bildung eines Gerinnsels in einem Blutgefäß führt und auch die Funktion der Blutplättchen von Wirbeltieren verändert.
Endotoxin ist ein Hauptbestandteil der Zellwand aller gramnegativen Bakterien; es kann nur schwer nachgewiesen werden und ist resistent gegen Medikamente.
Bang überredete Levin, einen Sommer am Marine Biological Laboratory in Woods Hole zu verbringen, wo er die Ähnlichkeiten zwischen Limulus-Amöbozyten und menschlichen Blutplättchen untersuchte.
Er zeigte schnell, dass das zellfreie Plasma einer Hufeisenkrabbe nicht gerinnt, aber als er die Blutzellen untersuchte, hatte er Schwierigkeiten, das Blut am Gerinnen zu hindern.
Er hatte noch ein weiteres Problem. Proben, die in Ordnung waren, als er das Labor nachts verließ, waren geronnen, als er morgens zurückkehrte, und keines der auf dem Markt erhältlichen Antikoagulanzien machte einen Unterschied.
Zufall führt zu einem Aha! Moment
Levin war verblüfft und versuchte verzweifelt, eine Lösung zu finden.
Könnte es an Bakterien oder einem Bestandteil von Bakterien liegen?
Um diese Möglichkeit zu testen, bereitete er neue Proben in sterilen, endotoxinfreien Glasgeräten vor. Erstaunlicherweise gerann das Blut nicht!
Da erkannte er, dass er einen Blutgerinnungsmechanismus identifiziert hatte, der durch das Vorhandensein von gramnegativem bakteriellem Endotoxin ausgelöst wurde.
Schließlich konnte er zeigen, dass der gesamte Blutgerinnungsmechanismus in Limulus in den Amöbozyten enthalten war und extrem empfindlich auf die Anwesenheit von Endotoxinen reagierte.
Limulus polyphemus Amöbozyten
“Ich denke, nur ein Forscher, der mit Endotoxin arbeitet, hätte jemals die Möglichkeit in Betracht gezogen, dass Endotoxin die Gerinnung von Limulus-Blut verursacht”, sagt Levin.
Dies führte dazu, dass Levin den extrem empfindlichen Limulus-Amebozyten-Lysat-Test (LAL) entwickelte und patentieren ließ, mit dem bakterielle Endotoxine mit Hufeisenkrebsblut nachgewiesen werden konnten.
Der einzige andere Test für Endotoxine war damals der Kaninchen-Pyrogen-Test. Damals verlangte die US Food and Drug Administration, dass alle injizierbaren Medikamente den Pyrogentest bestehen mussten, bevor sie zur Verwendung zugelassen werden konnten.
Der Kaninchen-Pyrogentest war jedoch ein kostspieliges, ineffizientes und oft ungenaues Verfahren.
Die Probe wurde einer Gruppe von Kaninchen injiziert. Wenn die Kaninchen Fieber bekamen, bestand das Medikament den Test nicht. Wenn sie innerhalb von 4-6 Stunden kein Fieber bekamen, war der Test bestanden.
Pharmaunternehmen mussten Tausende von Kaninchen unterbringen, um diese Tests durchführen zu können.
Der LAL-Test liefert in nur 45 Minuten ein Ergebnis und kann das Vorhandensein von Endotoxinen in Mengen von weniger als einem Teil pro Billion nachweisen.
Levin erkannte, dass er einen sehr empfindlichen und schnellen Test hatte! Dies war eine starke Konkurrenz für den Kaninchentest.
Der LAL-Test liefert in nur 45 Minuten ein Ergebnis und kann das Vorhandensein von Endotoxinen in Mengen von weniger als einem Teil pro Billion nachweisen.
Obwohl der LAL-Test erstmals 1965 beschrieben wurde, dauerte es fast 20 Jahre, bis der Test von der FDA offiziell als Endotoxin-Test für Endprodukte zugelassen wurde!
Warum hat es so lange gedauert?
Sagen wir es mal so: Die Menschen ändern nicht gerne etwas, und die Unternehmen sträuben sich gegen Veränderungen. Die Einführung des neuen, empfindlicheren Tests bedeutete, dass Pharmaunternehmen umrüsten und eine völlig neue Produktionslinie einrichten mussten.
Das kostet Zeit und Geld!
Aber die Sahne steigt schließlich nach oben; dieser Test war die Sahne der Ernte und ist es immer noch!
Die Nachfrage nach LAL ist jetzt so hoch, dass es zu einer der wertvollsten Flüssigkeiten auf der Erde geworden ist, mit einem gemeldeten Preis im April 2018 zwischen 35.000 und 60.000 $ pro Gallone!
Skalierung des LAL-Tests
Der LAL-Test wurde von der Johns Hopkins Bloomberg School of Public Health als einer der “100 wichtigsten Beiträge zur öffentlichen Gesundheit” bezeichnet.
Nach Angaben von Jack Levin ist er der Standard-Screening-Test für Endotoxin-Kontaminationen weltweit, wobei jedes Jahr etwa 17,5 Millionen Proben getestet werden (was etwa 70 Millionen durchgeführten Tests entspricht). Er wird kommerziell verwendet, um alle intravenösen Flüssigkeiten, parenteralen Medikamente und implantierbaren medizinischen Geräte zu testen, bevor sie bei Patienten eingesetzt werden.
Wie wird LAL hergestellt?
Hufeisenkrebse werden gefangen und ein Röhrchen wird in sie hineingesteckt, um ihnen das Blut abzusaugen (siehe Bild oben). Dann wird das gesammelte Blut zentrifugiert, um die Amöbozyten zu konzentrieren. Die Zugabe von Wasser zu den konzentrierten Amöbozyten führt dazu, dass diese auseinanderbrechen und die Gerinnungsproteine (das Lysat) freisetzen, die mit den Endotoxinen reagieren.
Diese Art der LAL-Herstellung wird als eine nicht tödliche Methode zur Gewinnung von Krabbenblut angepriesen. Aber das ist sie nicht. Denn nicht alle Krebse überleben!
Der Atlantic State Marine Fisheries Commission zufolge werden in ihrem 2019 Horseshoe Crab Stock Benchmark Stock Assessment and Peer Review Report 600.000 Horseshoe Crabs gefangen und entblutet, um den jährlichen LAL-Bedarf zu decken.
Von diesen 600.000 Krabben überleben etwa 420-540.000 (70-90 %) das Verfahren. Zusammen mit der Zerstörung des Lebensraums, der globalen Erwärmung und weiteren 500.000 Krabben, die jedes Jahr als Köder für die Aal- und Wellhornfischerei geerntet und getötet werden, wird deutlich, warum die Hufeisenkrebspopulationen immer weiter zurückgehen.
Nicht nur das, die Krebse werden im Mai und Juni geerntet, wenn sie in Scharen an Land kommen, um sich zu paaren, ihre Eier zu legen und hoffentlich ihr Überleben zu sichern.
Das ist keine nachhaltige Situation!
Gibt es bessere Möglichkeiten, LAL herzustellen?
“Der Amerikanische Hufeisenkrebs hat die Dinosaurier überlebt und vier frühere Massenaussterben überstanden, wird aber jetzt von der Pharmaindustrie, den Fischereigemeinschaften, dem Verlust von Lebensräumen, dem Klimawandel und, in jüngster Zeit, von erstickenden Fluten von Rotalgen vor der Ostküste der Vereinigten Staaten bedroht.” von Jonathan Watts in The Guardian
Es gibt zwei Hauptbemühungen, die als Mittel zur Milderung dieser unglücklichen Situation angepriesen werden.
Ein Ansatz, der von der Pharmaindustrie versucht wird, ist die Aquakultur von Hufeisenkrebsen.
Anfänglich waren die Versuche, Hufeisenkrebse zu züchten, nicht sehr erfolgreich. Es schien, dass nach 3 bis 4 Monaten der Zucht die Hämolymphproteinkonzentration auf ein Niveau sank, das zum Tod führte. Man nahm an, dass diese Todesfälle mit einem Nährstoffmangel zusammenhingen.
Dr. Anthony Dellinger ist Professor in der Abteilung für Neurowissenschaften an der Universität von North Carolina in Greensboro und Wissenschaftler bei Kepley Biosystems Incorporated, Greensboro, NC.
Dellinger und KBI haben hart an der Entwicklung eines neuen, verbesserten Aquakultur-Systems gearbeitet. Sie gehen davon aus, dass “die kontrollierte Gewinnung von LAL aus überwachten und gut gepflegten Hufeisenkrebsen in Aquakulturen die LAL-Versorgungsmengen erhöhen, die Lebensfähigkeit der Art sicherstellen und neue klinische Innovationen ermöglichen könnte”
Wenn dies gelingt, würde die zuverlässige, nachhaltige und wirtschaftliche Erzeugung größerer Mengen von LAL sowohl der Natur als auch der Industrie zugute kommen.
Dellinger und Kollegen haben die Funktionsweise ihres Aquakultur-Systems in einem im April dieses Jahres in Frontiers of Marine Science veröffentlichten Artikel detailliert beschrieben.
Wir wollen uns nun die Höhepunkte und Ergebnisse dieser Studie ansehen.
Zunächst optimierten sie ein Indoor-Aquakultur-Kreislaufsystem, das die Hufeisenkrebse zuverlässig hält. Ihr Ziel war es, die wiederholte LAL-Ernte zu erleichtern und gleichzeitig das Wohlbefinden der Tiere zu erhalten.
Der nächste Meilenstein war die Entwicklung einer Methode für eine schonende wiederholte Ernte. Dazu wurde dem Hufeisenkrebs chirurgisch ein Katheter implantiert. Alle Tests zeigten, dass die Hufeisenkrebse diese Katheter gut vertragen.
Hier eine kurze Zusammenfassung ihrer Ergebnisse.
Sie ernteten und pflegten 24 Krabben für ein Jahr mit 100% Überleben. Die Hufeisenkrebse wurden auf LAL-Aktivität, Ei- und Spermafreisetzung und andere Anzeichen, die auf eine beeinträchtigte Gesundheit hindeuten könnten, untersucht. Es wurden keine derartigen Anzeichen beobachtet.
Die Krebse wurden etwa dreimal pro Monat aus den Kathetern entlassen, was potenziell etwa 36 Blutungen pro Krebs über den Zeitraum von 12 Monaten entspricht. In diesem Zeitraum traten keine Probleme mit den implantierten Kathetern auf.
Bei der Berechnung der anfallenden Kosten, abgesehen von der anfänglichen Einrichtung des Aquakultur-Systems, belief sich der Unterhalt der Krabben auf etwa 0,76 $ pro Pfund, ein sehr günstiger Betrag!
Die wichtigste Frage, die es zu beantworten galt, lautete:
Wie verhält sich das LAL von den im Haus gehaltenen Hufeisenkrabben im Vergleich zu dem von frisch geernteten Krabben?
Wie in Abbildung 6 der Arbeit zu sehen ist, gab es keinen signifikanten Unterschied in der Endotoxin-Koagulationsaktivität des LAL zwischen den in Aquakultur gehaltenen und den wilden Krabben. Und es gab auch keinen wirklichen Unterschied in der Aktivität von Blutungen, die an den Tagen 1, 16 und 23 entnommen wurden.
Diese Ergebnisse führten zu der Schlussfolgerung,
“…die Aquakultur könnte den Bedarf der Industrie für mehrere Jahre mit dem Äquivalent von 5-10% des jährlichen Fangs eines Jahres decken, so dass danach jedes Jahr fast 600.000 HSC in freier Wildbahn verbleiben. Tatsächlich deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass ∼60.000 HSC aus Aquakultur 12-24 Mal pro Jahr nachhaltig geblutet werden könnten und den derzeitigen biomedizinischen LAL-Bedarf übersteigen.”
Der zweite Ansatz macht den Bedarf an Krabben vollständig überflüssig.
Jeak Ling Ding hatte zusammen mit ihrem Ehemann und Forschungspartner Bow Ho in Singapur ein Ziel – den Bedarf an Hufeisenkrabben vollständig zu eliminieren.
Sie untersuchte Carcinoscorpius rotundicauda, eine asiatische Spezies, die viel kleiner als atlantische Hufeisenkrebse war, und die man nicht viel bluten lassen konnte, ohne zu sterben.
Dings Forschungen über LAL führten zu der Entdeckung, dass ein Molekül namens Faktor C für die Gerinnungswirkung verantwortlich war. Ding isolierte das Gen für Faktor C und schleuste es mit Hilfe eines Virus in Darmzellen von Insekten ein. Dadurch verwandelten sich die Insekten in kleine Fabriken, die Faktor C produzierten.
Die veränderten Insekten stellen ausreichende Mengen an Faktor C her, der dann als rekombinanter* Faktor C (rFC) auf dem Markt als brauchbarer Ersatz für LAL verkauft werden konnte.
* Note: The word recombinant is a term used in molecular genetics to indicate a gene that has been isolated (cloned) and inserted into another organism's DNA so that organism makes the protein that gene specifies. Using a virus is one of many ways to accomplish this.
Anstatt also Hufeisenkrebse zu ernten oder in Aquakulturen zu züchten und sie ausbluten zu lassen, könnten sie nun große Mengen an Insekten züchten und den rFC isolieren.
Pharmaunternehmen, die rFC verwendet haben, haben bestätigt, dass es genauso gut wie LAL funktioniert und die Produktionskosten vergleichbar sind.
“Wir waren als Forscher einfach so begeistert, so glücklich, dass es funktioniert”, sagte Ding. “Und wir dachten, dass der rekombinante Faktor C auf der ganzen Welt angenommen und der Hufeisenkrebs gerettet werden würde.”
Leider stand rFC vor den gleichen Hindernissen für die Verbreitung wie LAL, als es eingeführt wurde. Obwohl rFC bereits seit 2003 auf dem Markt ist, hat es sich nur langsam durchgesetzt. Doch allmählich überwindet es die Hindernisse, die seiner Zulassung durch die FDA entgegenstanden. Ursprünglich gab es nur einen Hersteller – das in der Schweiz ansässige Chemieunternehmen Lonza Group.
Im Jahr 2013 wurde die Hyglos GmbH das zweite Unternehmen, das rFC herstellt. Kevin Williams, ein leitender Wissenschaftler bei Hyglos, sagt, dass er die Einführung und Zulassung von rFC als längst überfällig ansieht. Die Hyglos GmbH hat von mehreren europäischen Aufsichtsbehörden die Zulassung für ihre Verwendung erhalten.
Heute glauben Experten, dass rFC letztendlich die vorherrschende Methode zum Nachweis von Endotoxinen sein wird und die Hufeisenkrebse vollständig aus der industriellen Produktion verschwinden werden.
Damit können die Hufeisenkrebse leben!
Note: In these times of COVID-19, I wouldn't be surprised to see the obstacles removed even faster. Taking and applying research knowledge to improve patient wellbeing is happening faster than ever before. And in cases like this, that's a really good thing!
Was uns zu der letzten Frage bringt, auf die ich eingehen möchte:
Warum kümmert es uns überhaupt, ob Hufeisenkrebse überleben?
Sind sie nicht einfach nur uralte Relikte, auf die unser modernes Ökosystem gut verzichten könnte? Viele andere Arten sind ausgestorben, und der Planet scheint in Ordnung zu sein.
Das ist eine berechtigte Frage, also lassen Sie uns ein wenig tiefer in die Materie einsteigen.
Die spontane Antwort ist: “Natürlich wollen wir sie retten!” Es gibt genug Lebewesen auf diesem Planeten, die bereits bedroht sind oder die bereits ausgestorben sind. Wir können es uns einfach nicht leisten, noch mehr zu verlieren.
Wie ich schon sagte, ist das eher eine Bauchreaktion und keine Antwort, auf die man sich verlassen kann. Für eine bessere Antwort müssen wir uns ansehen, wie Hufeisenkrebse in das Gesamtbild passen.
Fangen wir damit an, was sie fressen und was sie frisst.
Der erwachsene Hufeisenkrebs ernährt sich von kleinen Weichtieren wie der Miesmuschel und der Brandungsmuschel sowie von Ringelwürmern.
Im Jahr 2017 sind Miesmuscheln laut diesem Bericht des Safina Center an der Stony Brook University nicht ernsthaft in Gefahr. Das Gleiche gilt für Ringelwürmer und Brandungsmuscheln.
Jungtiere ernähren sich von kleinen Partikeln aus Algen und tierischem Material. Mit zunehmender Größe des Tieres wächst auch die Beute, die es verzehrt.
Im Großen und Ganzen sieht es so aus, als ob die Hufeisenkrebse keine schädlichen Auswirkungen auf ihre Beutetiere haben.
Ok, das ist die eine Seite der Medaille. Was ist mit der anderen? Was frisst Hufeisenkrebse?
Die Eier der Hufeisenkrebse sind eine Nahrungsquelle für viele Organismen.
Dazu gehören Küstenvögel, einige Fische – gestreifte Barsche, gestreifte Killifische, Silberfische, Flundern – sowie Meeresschildkröten, Krabben und Wellhornschnecken. Sie sind eine wichtige Nahrungsquelle für 11 Arten von wandernden Küstenvögeln. Der Verlust dieser Eier würde diese Vogelpopulationen zerstören.
Die Unechten Karettschildkröten und Küstenvögel wie der Rote Knutt sind auf Hufeisenkrebse angewiesen.
Tausende dieser Schildkröten wandern im Sommer in die Chesapeake und Delaware Bay, um sich von den Krabben zu ernähren. Man nimmt jetzt an, dass die Unechten Krabben unter dem Mangel an Hufeisenkrebsen im Chesapeake leiden.
Ein paar Anekdoten berichten von Hufeisenkrabben, die in Alligator- und Haibäuchen auftauchen.
Die Jungtiere der Hufeisenkrabben könnten ebenfalls ein wichtiges Nahrungsmittel im Nahrungsnetz der Küsten sein. Den ganzen Sommer und Herbst über wimmelt es in den seichten Gewässern von Hufeisenkrabben im Larven- und frühen Lebensstadium. Diese Leckerbissen werden zweifellos auch von Fischen und Küstenvögeln verschlungen.
Und es sieht so aus, als gäbe es viele andere Tiere, die sie sehr schmackhaft finden und nur schwer einen einfachen Ersatz finden würden.
Für ein Lebewesen, das es seit 450 Millionen Jahren gibt, ist unser Wissen über die Rolle, die Limulus polyphemus im Ökosystem der Küsten spielt, noch lange nicht vollständig.
Nach dem derzeitigen Stand unseres Wissens über die Ökologie des Hufeisenkrebses können wir keine endgültigen Schlüsse darüber ziehen, wie wichtig seine Rolle ist. Was wir sagen können, ist, dass sie auf jeden Fall eine Nische besetzen, die eine ernsthaftere Untersuchung rechtfertigt.
Auch wenn das so ist, bin ich auf der Seite der Notwendigkeit, sie zu erhalten! Das ist meine “Vorsicht ist besser als Nachsicht”-Einstellung. Wir wissen einfach zu wenig, um zuzulassen, dass uns eine Art wie Limulus polyphemus durch die Lappen geht und verschwindet, wenn wir es verhindern können.
Kann man denn irgendetwas tun?
Wenn man zufällig in der Nähe eines Ortes wohnt, an dem Hufeisenkrebse ihre Eier ablegen, kann man leicht helfen. Es gibt Programme zum Krabbenfischen und zur Untersuchung von Laichkrabben, die auf freiwillige Helfer angewiesen sind.
Und schließlich: Denken Sie an den Hufeisenkrebs, wenn Sie zum Arzt gehen. Alles, was in unseren Körper injiziert oder implantiert wird, wird immer noch mit LAL aus Hufeisenkrebsblut auf gramnegative Bakterien getestet.
Bis zum nächsten Mal
Rich
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Für diesen Artikel verwendete Informationsquellen:
- Der Hufeisenkrebs
- Hufeisenkrebs-Aquakultur als nachhaltige Quelle für Endotoxin-Tests
- Die Rolle des Hufeisenkrebses in der biomedizinischen Industrie und aktuelle Trends, die sich auf die Nachhaltigkeit der Art auswirken
- Die letzten Tage der Blau-.Die letzten Tage der Blaubluternte
- Die Unterwassergeheimnisse der Hufeisenkrebse
- Diese Krabbe könnte Ihr Leben retten – wenn der Mensch sie nicht vorher ausrottet
- NJ hat seine Hufeisenkrebsernte beendet. Sollten andere Staaten das auch tun?
- Die Hufeisenkrabben-Seite von Kayla Westerlund
- Die Atlantische Hufeisenkrabbe