Abstract

Die Auswirkungen von Zink, Magnesium und Kalzium im Samenplasma auf die Zeit bis zur Schwangerschaft (TTP) bei gesunden Paaren, auf konventionelle Samenparameter und auf Parameter der computergestützten Samenanalyse (CASA) wurden bewertet. Die Lokalisierung von chelatierbaren Zinkionen im Samenplasma und in den Spermien wurde mittels Autometallographie (AMG) untersucht. Die Unterschiede in der Lokalisierung von chelatierbarem Zink in Proben mit hohem und niedrigem Gesamtzinkgehalt wurden bewertet. Spermaproben von 25 Paaren mit kurzer TTP und 25 Paaren mit langer TTP wurden einer konventionellen Spermaanalyse, CASA, Zink- und Magnesiummessungen mittels induktiv gekoppelter Plasmamassenspektrometrie und Kalziummessungen mittels Flammenatomabsorptionsspektrometrie unterzogen. Die Kationen waren stark miteinander korreliert, es wurde jedoch keine Korrelation mit der TTP oder konventionellen Spermaparametern festgestellt. Spermaproben mit hohen Zinkkonzentrationen wiesen eine statistisch signifikant schlechtere Motilität auf, die anhand der CASA-Parameter Geradengeschwindigkeit und Linearität bewertet wurde, als Proben mit niedrigem Zinkgehalt. Die Kalziumkonzentration wies ebenfalls statistisch signifikante Unterschiede bei denselben Parametern auf, aber der Effekt wurde durch Eingabe der Zinkkonzentration in ein multiples Regressionsmodell beseitigt. Spermaproben mit hohem Gesamtzinkgehalt wiesen eine stärkere Färbung des Samenplasmas bei AMG auf. Es wird vermutet, dass hohe Zinkkonzentrationen in der Samenflüssigkeit eine unterdrückende Wirkung auf die fortschreitende Motilität der Spermatozoen (Bewegungsqualität), nicht aber auf den Prozentsatz der beweglichen Spermatozoen (Bewegungsquantität) haben.

Einführung

Der Gesamtzinkgehalt im Sperma von Säugetieren ist hoch, und es wurde festgestellt, dass Zink für die Spermatogenese entscheidend ist. Zinkmangel wird beim Menschen mit Hypogonadismus und unzureichender Entwicklung der sekundären Geschlechtsmerkmale in Verbindung gebracht (Prasad, 1991) und kann bei der Ratte zu einer Atrophie der Hodenkanälchen und damit zu einem Versagen der Spermatogenese führen (Millar et al., 1958; Underwood, 1977; Endre et al., 1990). Es wurde berichtet, dass hohe Zinkkonzentrationen die Sauerstoffaufnahme in der Spermazelle (Huacuja et al., 1973; Foresta et al., 1990) und die Albumin-induzierte Akrosomreaktion (Foresta et al., 1990) beeinträchtigen. Die Befestigung/Ablösung des Kopf-Schwanzes und die Kondensation/Dekondensation des Kernchromatins werden ebenfalls durch Zink im Samen beeinflusst (Kvist, 1980; Bjorndahl und Kvist, 1982). Es gibt widersprüchliche Berichte über die Wirkung von Zink im Samen auf die Spermienmotilität (Stankovic und Mikac-Devic, 1976; Danscher et al., 1978; Caldamone et al., 1979; Lewis-Jones et al., 1996). Es wurde nachgewiesen, dass die Chelatbildung von Zinkionen die Spermienmotilität beeinträchtigt (Saito et al., 1967; Danscher und Rebbe, 1974), und es wurde vorgeschlagen, dass bioverfügbares Zink, das an vesikuläre Proteine mit hohem Molekulargewicht gebunden ist, und nicht das gesamte Spermazink ein Maß für die Wirkung von Zink auf die Spermienfunktion sein sollte (Bjorndahl et al., 1991; Carpino et al., 1998).

Diese Studie konzentriert sich hauptsächlich auf Zink. Es wurde der Zusammenhang zwischen Zink im Samen und in gewissem Maße auch Magnesium und Kalzium mit der Zeit bis zur Schwangerschaft (TTP) bei gesunden Paaren untersucht. Darüber hinaus wurde die Korrelation zwischen diesen zweiwertigen Kationen und konventionellen Samenparametern sowie Parametern der computergestützten Samenanalyse (CASA) bewertet.

Autometallographie (AMGZn) ist eine histochemische Methode zum Nachweis von Zinkionen und locker gebundenen Zinkionen (chelatbildendes Zink) in Gewebe. Untersucht wurden Unterschiede in der Zinkionenlokalisierung auf lichtmikroskopischer und elektronenmikroskopischer Ebene in den Spermien und im Samenplasma von Männern mit hohem und niedrigem Gesamtzinkgehalt.

Materialien und Methoden

Studienpopulation

Insgesamt wurden 430 Paare unter 52 255 Mitgliedern von vier Gewerkschaften rekrutiert. Von den 430 Paaren wurden Spermaproben entnommen, die Beweglichkeit wurde manuell und mit CASA (siehe unten) beurteilt, und die Proben wurden bis zur weiteren Analyse eingefroren (-20°C) gelagert. Paare ohne frühere Reproduktionserfahrung wurden aufgenommen, wenn sie die Empfängnisverhütung abbrachen, und wurden für mindestens sechs vollständige Menstruationszyklen oder bis zur Feststellung einer Schwangerschaft beobachtet. Von den 430 Paaren wurden 50 Paare, die schwanger wurden, für die vorliegende Studie ausgewählt: die 25 Paare mit der kürzesten TTP (S-TTP, Median 1 Monat, Bereich 1-2 Monate) und die 25 Paare mit der längsten TTP (L-TTP, Median 10 Monate, Bereich 7-28 Monate). Die Spermaproben dieser 50 Paare wurden den unten genannten Analysen unterzogen.

Konventionelle Spermacharakteristika

Die Spermaproben wurden durch Masturbation in 50 ml sterile Polystyrolgläser nach der empfohlenen dreitägigen Abstinenz gewonnen. Nach der Verflüssigung wurden die Proben bei Raumtemperatur gemäß den Kriterien der Weltgesundheitsorganisation (1992) analysiert.

Das Volumen wurde in einem 10-ml-Falcon-Glasröhrchen mit Graduierung (0,1 ml Genauigkeit) gemessen. Manuelle Spermienbeweglichkeitsmessungen wurden in einer Makler-Zählkammer (Sefi Medical Instruments, Haifa, Israel) durchgeführt. Jedes angetroffene Spermium wurde wie folgt eingestuft: a: schnelle progressive Motilität, b: langsame oder träge progressive Motilität, c: nicht-progressive Motilität, d: Unbeweglichkeit. Es wurden mindestens 2×100 Wertungen vorgenommen. Wenn die Differenz zwischen zwei aufeinanderfolgenden Zählungen mehr als 10 % betrug, wurden zwei neue Zählungen durchgeführt. Der prozentuale Anteil der beweglichen Spermien wurde als Gruppe “a + b + c” definiert. Die Konzentration wurde in einer Makler-Zählkammer gemessen, und die Morphologie wurde nach den von Kruger et al. (1986) beschriebenen “strengen” Tygerberg-Kriterien an luftgetrockneten, in Ethanol und Äther fixierten und mit der Papanicolaou-Technik gefärbten Abstrichen klassifiziert (Weltgesundheitsorganisation, 1992). Die Bewertung der Morphologie wurde von einem einzigen geschulten Labortechniker vorgenommen. Die Lebensfähigkeit der Spermien wurde anhand von Eosin-Negrosin-gefärbten Ausstrichen bestimmt.

Computerunterstützte Spermaanalyse

Das Material für CASA wurde wie folgt gewonnen: 4,5 μl frischer, gut gemischter Spermatozoen wurden mit einer Pipette in eine Makler-Zählkammer mit einer Tiefe von 10 μm übertragen. Die Probe wurde in ein Olympus BH-2 Phasenkontrastmikroskop (Olympus Denmark A/S, Glostrup, Dänemark) mit einer Heizplatte (37°C) bei ×200 Vergrößerung gelegt. Eine Sony-Videokamera DXC-107 (Sony Corp., Tokio, Japan) übertrug die Bilder auf einen Sony PVM-1440QM Farbvideomonitor (Sony Corp., Tokio, Japan). Die Bilder wurden mit einem JVC HR-D560EG/E Videorekorder (JVC Victor Company of Japan, Tokio, Japan) aufgezeichnet. Die Aufnahmen wurden später mit einem Hobson Sperm Tracker (Hobson Tracking Systems Ltd, Sheffield, UK) bei einer Aufnahmefrequenz von 25 Hz, einer Verfolgungszeit von 2 s (insgesamt 50 Bilder) und einem Sichtfeld von 300×300 μm (so dass alle geradlinigen Geschwindigkeitswerte von bis zu 150 μm/s erfasst werden können) analysiert. Pro Probe wurden 100 Spermien analysiert.

Aus den Analysen wurden folgende Parameter abgeleitet: gekrümmte Geschwindigkeit (VCL), geradlinige Geschwindigkeit (VSL), Linearität (LIN), durchschnittliche Bahngeschwindigkeit (VAP) und Amplitude der lateralen Kopfverschiebung (ALH).

Bestimmung von Zink, Magnesium und Kalzium im Sperma

Zink, Magnesium und Kalzium im Sperma wurden in allen 50 Proben gemessen. Die Zink- und Magnesiumkonzentrationen im Sperma wurden durch induktiv gekoppelte Plasmamassenspektrometrie (ICP-MS) bestimmt. Das Gerät war ein PQ2+ von Fisons Elemental (Winsford, Cheshire, UK). Ein Aliquot von 20 μl wurde 100-fach mit einer Lösung verdünnt, die 5 g/l 25%igen Ammoniak (ARISTAR; Merck, Poole, UK), 0,5 g/l EDTA (Janssen Chimica, Geel, Belgien) und 0,5 g/l Triton X-100 (Sigma, St Louis, MO, USA) in 18 MW Millipore-Wasser enthielt. Als interner Standard wurde Scandium (AccuStandard, New Haven, CT, USA) in einer Endkonzentration von 100 μg/l zugesetzt. Alle Proben wurden in doppelter Ausführung hergestellt. Die Kalibrierung wurde mit Leerproben durchgeführt, denen Zink und Magnesium (AccuStandard) in einer Endkonzentration von 1, 2 und 3 mg/l zugesetzt wurden, was den Konzentrationen von 100, 200 und 300 mg/l in den ursprünglichen Samenproben entsprach. Diese Analyse wurde im Peak-Spring-Modus mit Messungen bei 24Mg, 66Zn und 45Sc durchgeführt.

Die Bestimmung von Calcium erfolgte in denselben Präparaten mittels Flammen-Atomabsorptionsspektrometrie (FAAS). Das Gerät war ein Perkin-Elmer 306 (Norwalk, CT, USA). Die Kalibrierung wurde für Konzentrationen durchgeführt, die 100, 200 und 400 mg/l in den ursprünglichen Samenproben entsprachen. Proben mit hohen Kalziumkonzentrationen wurden dreimal weiter verdünnt, um in die Kalibrierungskurve zu fallen.

Die Nachweisgrenzen, berechnet als dreifache Standardabweichung für 10 Blindproben, die bei der gleichen Gelegenheit wie die Proben hergestellt wurden, betrugen 1 mg/l für Zink, 3 mg/l für Magnesium und 2 mg/l für Kalzium (ausgedrückt als Konzentrationen in den unverdünnten Samenproben). Die aus den Ergebnissen der Doppelanalysen berechneten Gesamtvariationskoeffizienten der Bestimmungen betrugen 18 % für Zink, 32 % für Magnesium und 17 % für Calcium.

In zehn der Proben wurden auch Präparate für die Bestimmung von Zink mittels Flammen-Atomabsorptionsspektrometrie (FAAS) hergestellt. Die lineare Regressionsanalyse der ICP-MS- gegenüber den FAAS-Ergebnissen ergab eine Steigung von 0,79 (95% Konfidenzintervall: 0,58-1,00), einen Achsenabschnitt von 13 μg/l und r2 von 0,90. Die etwas höheren Ergebnisse für die ICP-MS-Analysen waren somit statistisch nicht signifikant.

Autometallographische (AMG) Entwicklung von Samenausstrichen für die lichtmikroskopische Analyse

Fünf Proben mit hohem (242-308 mg/l) und fünf mit niedrigem (38-57 mg/l) Zinkgehalt, wie durch ICP-MS bestimmt, wurden 30 Minuten lang in 0,5%igem Natriumsulfid (Bie & Berntsen) inkubiert, um Zinksulfidgitter zu erzeugen. Von der Ejakulat/Sulfid-Lösung wurden Ausstriche auf mit Farmer gespülten Glasobjektträgern gemacht. Die Ausstriche wurden an der Luft getrocknet, 30 Minuten lang in 3%igem Glutaraldehyd (Bie & Berntsen) fixiert und 3×2 Minuten lang in 0,1 M Phosphatpuffer und einmal 2 Minuten lang in destilliertem Wasser eingelegt.

Die Ausstriche wurden dann mit AMG entwickelt, um die Zinksulfid-Gitter zu versilbern. Der Entwickler bestand aus 60 ml filtrierter Gummiarabikumlösung (1 kg gelöst in 2 l destilliertem Wasser; Bidinger A/S, Aarhus, Dänemark), 10 ml Natriumcitratpuffer und 0,85 g Hydrochinon (Merck, Darmstadt, Deutschland), gelöst in 15 ml warmem, destilliertem Wasser. Unmittelbar vor der Verwendung wurden 0,11 g Silberlactat (Fluka, Buchs, Schweiz) in 15 ml destilliertem Wasser zugegeben und die Lösung gründlich gemischt.

Die gespülten Gläser mit den Samenausstrichen wurden in ein 26°C warmes Wasserbad gestellt und in eine lichtdichte Box überführt. Der frisch zubereitete AMG-Entwickler wurde in die Gläser gegossen, und die Ausstriche wurden 30 Minuten lang in der dunklen Box entwickelt.

Nach der Entwicklung wurden die Ausstriche 10 Minuten lang in fließendem entionisiertem Wasser gespült, 5 Minuten lang in 5%igem Natriumthiosulfat eingelegt, 2 Minuten lang mit fließendem entionisiertem Wasser gewaschen, 30 Minuten lang mit 70%igem Ethanol nachfixiert und schließlich 2 Minuten lang mit fließendem entionisiertem Wasser gewaschen. Die Gegenfärbung erfolgte mit einer 0,1%igen wässrigen Toluidinblau-Lösung, pH 4,0 (1 g Toluidinblau in 1000 ml Puffer: 614,5 ml 0,1 M Zitronensäure-Monohydrat und 385,5 ml 0,2 M Di-Natriumhydrogenphosphat-Dihydrat; Merck, Darmstadt, Deutschland). Die Ausstriche wurden 2 × 2 min in destilliertem Wasser, 3 × 3 min in 99%igem Ethanol, 3×3 min in Xylol gelagert und schließlich mit DEPEX (Merck, Darmstadt, Deutschland) montiert.

Präparationen von Spermaausstrichen für die elektronenmikroskopische Analyse

Ausstriche von Spermaproben wurden wie oben beschrieben präpariert, jedoch nicht mit DEPEX montiert. Nach der Prozedur wurde 0,5%iges Osmiumtetroxid für 30 Minuten zugegeben, und die Ausstriche wurden 3×2 Minuten in Puffer und 1×2 Minuten in destilliertes Wasser gelegt. Die mit Osmium kontrastierten Ausstriche wurden im Lichtmikroskop untersucht, und die für weitere elektronenmikroskopische Analysen interessanten Bereiche wurden mit einem Diamantmesser markiert.

Die ausgewählten Ausstriche wurden in abgestuften Ethanollösungen dehydriert und in Epon (Bie & Berntsen) eingebettet. Die Eponblöcke, die auf die zuvor markierten Bereiche von Interesse gelegt wurden, wurden 24 h lang bei 60 °C gelagert und dann von den Glasausstrichen abgebrochen. Halbdünne (3 μm) Schnitte wurden geschnitten und auf Glasobjektträger gelegt. Nach lichtmikroskopischen Analysen wurden ausgewählte Schnitte erneut in Epon eingebettet und ultradünne Schnitte angefertigt, die vor der Untersuchung in einem JEOL 100S Elektronenmikroskop mit Bleizitrat gegengefärbt wurden.

Statistische Methoden

Mehrfache Regressionsanalysen wurden auf die Daten angewandt, um die Auswirkungen der einzelnen Parameter auf das Ergebnis zu ermitteln. Für mehrere Korrelationen wurden Spearman’s Rangkorrelationskoeffizienten berechnet. Zum Vergleich der Gruppen wurde der Wilcoxon-Rangsummentest für die Differenz der Mediane durchgeführt.

Ergebnisse

In Tabelle I sind die Zink-, Magnesium- und Kalziumgehalte zusammen mit dem relativen Anteil der Kationen im Samenplasma dargestellt. Der Vergleich der Mediane für diese Parameter in den beiden Gruppen S-TTP versus L-TTP durch t-Tests mit zwei Stichproben ergab für keinen dieser Parameter statistisch signifikante Unterschiede. Eine starke positive Interkorrelation wurde zwischen Zink, Magnesium und Kalzium festgestellt (Spearman’s Rangkorrelationskoeffizienten waren 0,79-0,86, P < 0,01) (Abbildung 1).

Keines der Kationen war eng mit einem der herkömmlichen Samenparameter korreliert. Bei der Durchführung einer multiplen Regressionsanalyse für alle Daten ergab sich nur für den Zinkgehalt ein P-Wert unter 0,05 für die folgenden CASA-Parameter: VSL 0,04, und LIN 0,008. Die Aufnahme von Magnesium oder Kalzium in das Modell führte nicht zu einer Verbesserung der Werte.

Die Spermaproben wurden nach dem Kationenstatus der einzelnen Kationen in zwei gleich große Gruppen aufgeteilt. Es wurden folgende Trennungspunkte (Mediane für alle 50 Proben) ermittelt: Zink 112 mg/l, Magnesium 98 mg/l und Calcium 476 mg/l. Es wurden eine Reihe statistisch signifikanter Unterschiede zwischen den beiden Gruppen festgestellt (Tabelle II). Die P-Werte für die Zinkgruppen wiesen die größten Unterschiede auf, die Calciumgruppen wiesen mittlere Unterschiede auf, und die Magnesiumgruppen wiesen nur geringe Unterschiede auf (außer LIN).

Für das relative Verhältnis zwischen den Kationen (Tabelle III) waren die Teilungspunkte: Zink:Magnesium 1,26 und Zink:Calcium 0,22. Die Proben mit einem Zink:Calcium-Verhältnis über 0,22 zeigten statistisch signifikant niedrigere Werte für die CASA-Parameter VSL, LIN und STR im Vergleich zu den Proben mit einem Verhältnis unter 0,22. Die Korrelation Zink:Magnesium liegt bei 0,86 (Rangkorrelationskoeffizient nach Spearman) und für Zink:Calcium bei 0,79. Der Zinkgehalt scheint enger mit dem Magnesiumgehalt verbunden zu sein als der Kalziumgehalt, was den Unterschied zwischen den Gruppen erklären könnte.

Bei der Bewertung des Zinkionengehalts in AMG-Präparaten wurde auf lichtmikroskopischer Ebene ein Unterschied zwischen Proben mit niedrigem Gesamtzinkgehalt und Proben mit hohem Gesamtzinkgehalt festgestellt. Abbildung 2 zeigt die Unterschiede in der AMG-Färbung in einer Probe mit 299 mg/l und einer Probe mit 53 mg/l Samenzink. Die Färbung um das Akrosom, den Schwanz und im Samenplasma war in den Proben mit niedrigem Gesamtzink spärlich ausgeprägt. Diese Befunde konnten elektronenmikroskopisch nicht bestätigt werden (Abbildung 3A), und insbesondere wurde kein Unterschied in der intrazellulären Färbung der Spermatozoen festgestellt. Die Abbildungen 3B und 4 zeigen die Lokalisierung der Zinkionen im Schwanz der Spermatozoen. Es findet sich im gesamten Schwanz, konzentriert in den akzessorischen Geißelfasern und der Membran. Im Samenplasma wurden mikrometergroße Körper gefunden, die reich an Zinkionen sind (Abbildung 5).

Diskussion

Soweit wir wissen, ist dies die erste Studie, die die Auswirkungen von Zink, Magnesium und Kalzium im Samen auf die TTP- und CASA-Parameter bei gesunden Menschen untersucht. Es wurde ein Zusammenhang zwischen hohen Zinkkonzentrationen und einer geringen Linearität der Spermienbewegungen festgestellt, die sich in einem Rückgang von VAP, VSL, STR und LIN ausdrückt. Die Magnesium- und Kalziumkonzentrationen standen in engem Zusammenhang mit der Zinkkonzentration, waren jedoch nicht so stark mit den CASA-Parametern verbunden. Es wurde festgestellt, dass die Gesamtkonzentration von Zink, Magnesium und Kalzium keinen Einfluss auf die motile Konzentration hat. Es wurden jedoch Unterschiede zwischen hohem und niedrigem Zinkgehalt und einigen CASA-Parametern festgestellt (Tabelle II). Beim Vergleich der 25 Spermaproben mit dem niedrigsten Gesamtzinkgehalt (Median 72 mg/l) mit den 25 Proben mit dem höchsten Gesamtzinkgehalt (Median 187 mg/l) ergab der Wilcoxon-Rangsummentest einen statistisch signifikanten Unterschied in den Medianen für VSL (P = 0,004) sowie LIN (P = 0,001). Für VAP war der Unterschied ebenfalls signifikant (P = 0,02). Für VCL wurde kein Unterschied festgestellt. Da es in den Proben mit niedrigem und hohem Zinkgehalt keine Unterschiede in der prozentualen Beweglichkeit oder der Beweglichkeitskonzentration gab, scheinen sich die Spermien in einer zinkreichen Umgebung eher zufällig und weniger vorwärts zu bewegen. Es scheint die Anzahl der beweglichen Spermien nicht zu verringern.

VSL drückt aus, wie weit sich die Spermie in einer bestimmten Zeitspanne geradeaus bewegt, und ist aus klinischer Sicht wahrscheinlich der wichtigste CASA-Parameter. Eine Studie von Moore und Akhondi (1996) über die Befruchtungsfähigkeit epididymaler Rattenspermien zeigte, dass eine Abnahme der VSL in hohem Maße negativ mit dem Ergebnis der Befruchtung in vitro korreliert.

Im Laufe der Jahre wurde viel über die Rolle von Zink im Samenplasma auf die Spermienfunktionen diskutiert. Der Spermienkopf akkumuliert eine vielfach höhere Konzentration als das Samenplasma, und Zink ist wesentlich für die Chromatinstabilität und die Fähigkeit des Chromatins, sich zum richtigen Zeitpunkt zu dekondensieren (Kvist, 1982; Kvist und Bjorndahl, 1985; Kvist et al., 1987, 1988), und es wurde eine physiologische Rolle für Zink als Bewahrer eines inhärenten Mechanismus für die Kopf-Schwanz-Ablösung vorgeschlagen (Bjorndahl und Kvist, 1982). Es gibt jedoch widersprüchliche Berichte über die Wirkung von Zink im Samen auf die Spermienmotilität, und die meisten Studien befassten sich mit quantitativen Bewertungen. In einer Studie von Lewis-Jones et al. (1996) wurden bei 1178 Patienten, die zur Fruchtbarkeitsbehandlung überwiesen wurden, die Zink- und Fruktosekonzentrationen im Samenplasma gemessen, wobei für Zink kein statistisch signifikanter Zusammenhang mit der Motilität festgestellt wurde. Abou-Shakra et al. (1989) haben mehrere Spurenelemente im Samenplasma mittels ICP-MS gemessen, konnten jedoch keinen Zusammenhang zwischen der Zinkkonzentration im Samen und der Spermiendichte oder -motilität bei normospermischen, oligospermischen oder azoospermischen Männern feststellen. Die Zinkkonzentrationen in ihrer Studie waren ähnlich hoch wie die in der vorliegenden Studie angegebenen Werte. Danscher et al. (1978) berichteten, dass hohe Zinkkonzentrationen mit einer verminderten Spermienmotilität einhergehen, während andere Forscher berichteten, dass ein hoher Zinkgehalt im Samenplasma mit einem hohen Grad an Spermienmotilität einhergeht (Stankovic und Mikac-Devic, 1976; Caldamone et al., 1979).

In dieser Studie haben wir uns sowohl mit der quantitativen Bestimmung des Gesamtzinkgehalts als auch mit der qualitativen Bestimmung der Zinkionenlokalisierung in der Samenzelle und der Samenflüssigkeit beschäftigt. Obwohl auf ultrastruktureller Ebene (Abbildung 2A) keine Unterschiede im Zinkionengehalt der Spermien zwischen den Proben mit hohem oder niedrigem Gesamtzinkgehalt festgestellt wurden, könnten die auf lichtmikroskopischer Ebene (Abbildung 1) gesehenen Merkmale eine Beziehung zwischen der Gesamtmenge an Zink und freien Zinkionen im Samenplasma widerspiegeln. In neueren Studien sind Lewis-Jones et al. (1996) und Carpino et al. (1998) zu dem Schluss gekommen, dass das Gesamtzink im Sperma ein unzuverlässiger Marker für die spermatogene Aktivität ist, und schlagen vor, dass bioverfügbare Zinkionen, die an vesikuläre Proteine mit hohem Molekulargewicht gebunden sind, ein besserer Index sind. Die hier vorgestellte AMG-Methode weist chelatierbares Zink nach, d. h. Zinkionen im Plasma oder locker an Makromoleküle gebundenes Zink. Fest an Proteine gebundenes Zink wird von der AMG nicht erfasst und kann nicht chelatiert werden. Wir stimmen mit den genannten Studien überein, dass es das bioverfügbare (also chelatierbare) Zink ist, das Funktionen auf die Spermien ausübt, einschließlich der Motilität. Diese Studie deutet darauf hin, dass die Konzentrationen von Gesamtzink und chelatierbarem Zink miteinander zusammenhängen. Weitere Studien sind notwendig, und die computergestützte Bildanalyse, z.B. von AMG-Präparaten, könnte ein wichtiges Hilfsmittel sein.

Im Gegensatz zu den Auswirkungen von Zink schien eine hohe Magnesiumkonzentration an sich keine hemmende Wirkung auf die Spermienmotilität zu haben. Es wurde ein negativer Effekt auf LIN festgestellt, der jedoch nicht groß genug war, um sich auf die anderen CASA-Parameter auszuwirken. Es wurde berichtet, dass das menschliche Samenplasma sekretorische Körnchen und Vesikel prostatischen Ursprungs enthält, die eine regulierende Wirkung auf die Spermienmotilität haben könnten, indem sie die Konzentration essentieller Kationen in ihrer Umgebung modulieren (Stegmayr et al., 1982). Die Membranen dieser Organellen enthalten Mg2+- und Ca2+-abhängige ATPase, die durch Zn2+ kompetitiv gehemmt wird (Ronquist et al., 1978a,b). Über eine hohe positive Korrelation zwischen Zink und Magnesium im Samenplasma wurde bereits berichtet (Papadimas et al., 1983; Umeyama et al., 1986), und in dieser Studie wurden ähnlich starke Interkorrelationen zwischen allen drei Kationen gefunden (r = 0,79-0,86, P < 0,01).

Calcium ist wichtig für die Spermienphysiologie einschließlich der Motilität (Morton et al., 1974; Lindemann et al., 1987), den Stoffwechsel (Peterson und Freund, 1976), die Akrosomreaktion und die Befruchtung (Yanagimachi und Usui, 1974; Yanagimachi, 1981). Die Rolle von Kalzium in der Samenflüssigkeit bei der Spermienmotilität ist jedoch noch nicht vollständig geklärt. Thomas und Meizel (1988) fanden heraus, dass die Chelatisierung extrazellulärer Kalziumionen mit EGTA die Akrosomreaktion hemmt, aber gleichzeitig keine Auswirkungen auf die Motilität hat. Die Zugabe des die Akrosomreaktion auslösenden Ionophors für zweiwertige Kationen, Ionomycin, hatte ebenfalls keine Auswirkung auf die Motilität, erhöhte aber die Anzahl der akrosom reagierenden Spermien erheblich. Magnus et al. (1990) fanden keinen Zusammenhang zwischen den Konzentrationen an ionisiertem Kalzium und dem Anteil der Spermien, die eine progressive Bewegung aufweisen. Arver und Sjöberg (1982) berichteten, dass niedriges ionisiertes Kalzium mit mehr und besser progressiv beweglichen Spermien verbunden ist. Prien et al. (1990) verglichen Spermienmotilität, -geschwindigkeit und -progression mit Gesamtkalzium und ionisiertem Kalzium bei Patienten mit normaler (>60%) und verminderter (<60%) Spermienmotilität. Es wurde kein Unterschied im Gesamtkalzium festgestellt, aber ein statistisch signifikanter Rückgang des ionisierten Kalziums im Sperma wurde bei den Männern mit verminderter Beweglichkeit festgestellt. In dieser Studie wurde das Gesamtkalzium gemessen, aber die Kalziumbindungskapazität des Samenplasmas ist nicht bekannt. Wie beim Kalzium wurde kein Einfluss auf die Motilitätskonzentration festgestellt, und die Korrelationen zu den CASA-Parametern waren schwächer als die für Zink (Tabelle II). Sowohl VSL als auch LIN wiesen inverse signifikante Korrelationen zur Gesamtkalziumkonzentration auf (P = 0,02 für beide), während VCL davon nicht betroffen war. Durch die Einbeziehung der Zinkkonzentration in eine multiple Regressionsanalyse wurden jedoch die Auswirkungen der Gesamtkalziumkonzentration auf die Motilität aufgehoben. Dies steht im Einklang mit der bereits erwähnten Studie von Prien et al. (1990). In dieser Studie wiesen Proben mit einem niedrigen Zink:Calcium-Verhältnis statistisch signifikant bessere CASA-Werte (VSL, LIN und STR) auf als solche mit einem hohen Verhältnis. Dies ist hauptsächlich auf Unterschiede in der Zinkkonzentration zurückzuführen.

Die Präzision der Zink-, Magnesium- und Calciumbestimmungen in dieser Studie war mit Variationskoeffizienten von 18, 32 bzw. 17 % relativ schlecht. Der Grund dafür ist wahrscheinlich die Inhomogenität der Proben, die in Kombination mit den kleinen Probenvolumina (20 μl) die Präzision beeinträchtigt haben könnte. Trotz der großen Ungenauigkeit war die Abweichung bei der Bestimmung von Zink und Magnesium im Vergleich zu dem großen Konzentrationsbereich in den Proben gering.

Es wurde bereits nachgewiesen, dass die Chelatbildung von Zinkionen die Spermienmotilität beim Menschen (Danscher und Rebbe, 1974), bei der Ratte und beim Hund (Saito et al., 1967; Stoltenberg et al., 1997) beeinflusst. Gegenwärtig werden Studien mit intra- und extrazellulärer Chelatisierung von Zinkionen durchgeführt, was die Bedeutung der Lage der Zinkionen in der Samenflüssigkeit und in der Spermazelle aufzeigen könnte.

Die Autoren danken Frau H. Brandstrup, Frau D. Jensen, Frau K. Lunding, Frau K. Wiedemann, Frau Anna Akantis und Herrn A. Meier für ihre fachkundige technische Unterstützung. Die Danish Fecundity Study Group unterstützte diese Studie, die Teil einer gemeinsamen Folgestudie über die umweltbedingten und biologischen Determinanten der Fruchtbarkeit ist. Das Projekt wird vom Steno Institute of Public Health der Universität Aarhus koordiniert und in Zusammenarbeit mit der Abteilung für Wachstum und Fortpflanzung des Nationalen Universitätskrankenhauses in Kopenhagen durchgeführt. Die Studie wurde hauptsächlich durch einen Zuschuss der Forschungsstiftung der Universität Aarhus (J 1994-7430-1) unterstützt. Weitere Unterstützung kam vom Danish Medical Research Council (J 12-2042-1), der Danish Health Insurance Foundation (J 11/243-91, J 11/236-93), Fonden til Lægevidenskabens Fremme (A.P.Møller) und The Ciconia Foundation.