1.4.3.2 Hyttyset
Hyttyset ovat vakavien ihmissairauksien, kuten malarian, denguekuumeen ja keltakuumeen, vektoreita, ja huolimatta ponnisteluista niiden valvomiseksi ne ovat edelleen vakava ongelma. Uusien hyttysgeenien tunnistamisen, jotka osallistuvat muun muassa hajuaistiin, veren syömiseen, ruoansulatukseen, lisääntymiseen ja immuniteettiin, odotetaan tarjoavan perustan uusien menetelmien kehittämiselle hyttyspopulaatioiden ja hyttysten levittämien tautien hallitsemiseksi (Chen et al.,
Kolmen tärkeimmän hyttysvektorin, Anopheles gambiae, Aedes aegypti ja Culex pipiens quinquefasciatus (http://www.vectorbase.org/), hiljattain saatuja genomisekvenssitietoja on käytetty vertailevaan genomiikkaan ja transkriptioprofiilitutkimuksiin, jotka mahdollistavat suurten määrien uusien hyttysgeenien tunnistamisen. RNAi:stä on tullut nopeasti ensisijainen väline geenien toiminnan luonnehtimiseksi monilla hyttysbiologian ja hyttysen ja patogeenin vuorovaikutuksen aloilla (esim. Fragkoudis ym., 2009). Tämä on johtanut varsin lukuisten toiminnallisten RNAi-määritysten julkaisemiseen tässä organismiryhmässä, mukaan luettuina aedines- (A. aegypti, Armigeres subalbtus ja C. pipiens) ja anophelines-heimon jäsenet (A. gambiae ja Anopheles stephensi). Useimmat näistä tutkimuksista ovat kuitenkin keskittyneet vain kahteen lajiin: denguekuumeen ja keltakuumeen pääasialliseen levittäjään A. aegyptiin ja malarian afrikkalaiseen levittäjään A. gambiaeen (taulukko 1.1).
Näissä tutkimuksissa tyypilliseen koestrategiaan kuului dsRNA:n mikroinjektio aikuisten hyttysten rintakehään, jota seurasi ruokinta, patogeenien, hajuaineiden, hyönteismyrkkyjen tai stressiolosuhteiden aiheuttama haaste, ja hyttysten myöhempi tutkiminen, jotta voitiin analysoida kohdennetun geenin vaimentamisen fenotyyppistä vaikutusta tutkittavaan fysiologiseen prosessiin, mukaan lukien hajuaistimus, ruokailu, ruuansulatus, ruoansulatuskanava ja aineenvaihdunta, stressi, myrkytyksen poisto, kutikulaarinen kudosmuodostusta koskeva toiminta, lisääntymisvaikutus, koskemattomuus ja diapaussin sääntely. Seuraavassa esitellään joitakin edustavia tutkimuksia RNAi:stä hyttysillä.
Haju välittää monenlaista sekä aikuisten että toukkien käyttäytymistä, mukaan lukien ravinnonhankinta, isännän mieltymys, parittelupaikan löytäminen/valinta ja lisääntymispaikkojen valinta munintaa varten. Haju liittyy hajumolekyylien aiheuttamien kemiallisten ärsykkeiden havaitsemiseen ja spesifisten vasteiden kehittämiseen tällaisiin ärsykkeisiin. Hajuaineet tarttuvat hajuaineita sitoviin proteiineihin (OBP), jotka kuljettavat ne hajuhermosolujen dendriittisillä kalvoilla oleviin hajureseptoreihin (OR). Sekä OBP- että OR-geenien viimeaikainen RNAi-kohdennus on tuottanut arvokasta tietoa niiden toiminnasta hajuaistin mekanismissa ja spesifisyydestä (Biessmann ym., 2010; Liu ym., 2010; Pelletier ym, 2010), mikä avaa mahdollisuuden muuttaa hajuaistimusta ja siten erilaisia käyttäytymismalleja, jotka voisivat johtaa hyttysen puremisen ja parittelun estämiseen.
Lämpimissä ilmasto-oloissa aikuiset naarashyttyset talvehtivat diapausessa, lepojaksossa, jolle on ominaista isännänhakukäyttäytymisen puuttuminen, valtavien rasvavarastojen kertyminen ja munasarjojen kehityksen pysähtyminen. Tämän lepotilan säätelyä manipuloimalla voitaisiin esimerkiksi saada aikaan lepotilassa olevia, ei-isännänhakuisia hyttysiä. Tästä on saatu esimerkkejä useissa Denlingerin tutkimusryhmän tutkimuksissa. Erityisesti he ovat hiljattain käyttäneet RNAi:tä tutkiessaan C. pipiens -lajin diapaussimekanismia ja osoittaneet, että insuliini/FOXO-signalointireitti osallistuu diapaussin säätelyyn (Sim ja Denlinger, 2008, 2009a). Heillä on myös näyttöä joidenkin rasvahapposyntaasien osallisuudesta rasvavarastojen kertymiseen talvehtivilla naarailla (Sim ja Denlinger, 2009b) ja ribosomiproteiinien S3 ja S2 roolista follikkelin kehityksessä ei-diapaussi-naarailla (Kim ja Denlinger, 2010; Kim ym., 2010).
Vitellogeneesiä ja lisääntymistä on myös luonnehdittu RNAi:lla hyttysillä. Samoin kuin punkkien kohdalla, anautogeeniset hyttyset vaativat selkärankaisen isännän veren nauttimista aloittaakseen lisääntymissyklin, johon kuuluu munien tuottaminen. Hyttysen rasvakudos käyttää verijauhosta saatuja aminohappoja (AA) syntetisoidakseen keltuaisproteiinin esiasteita, pääasiassa vitellogeniinia (Vg), prosessissa, jota kutsutaan vitellogeneesiksi. Sen jälkeen Vg vapautuu hemolymfaan, ja munasarjat ottavat sen vastaan ja laskeutuvat kehittyviin munasoluihin spesifisen VgR:n välityksellä.
Hyttysen A. aegypti Vg-geenin ilmentymistä on tutkinut intensiivisesti tohtori Raikhelin työryhmä pitkässä sarjassa tyylikkäitä kokeita, joissa he käyttivät käänteisen funktionaalisen genomiikan välineenä RNAi:tä. Ryhmä osoitti, että Vg-geenin transkriptiota säätelee tiukasti useiden molekyylien, kuten steroidihormoni 20-hydroksiekdysonin (20E) kaskadin ja ravitsemuksellisen AA/Target-of-Rapamycin (TOR) -signaalin yhdistetty panos. Tämä seriini/treoniinikinaasi vastaa AA-signaalin välittämisestä ja aktivoi S6-kinaasin fosforylaation, jota tarvitaan translaatiotapahtumien aktivoimiseksi (Park ym., 2006; Roy ja Raikhel, 2011). Lisäksi sama ryhmä on tuottanut spesifisen antagomirin injektoinnilla miRNAi miR-27:n RNAi-välitteisen köyhtymisen osoittaakseen miR-27:n toiminnan positiivisena säätelijänä sekä veren sulatuksessa että munan kehityksessä. Itse asiassa miR-27:ää sinänsä säätelevät 20E- ja AA/TOR-reitit (Bryant ym., 2010).
Hyttysvektoreiden synnynnäinen immuunijärjestelmä käsittää kolme funktionaalista geeniryhmää, jotka osallistuvat patogeenien tunnistamiseen, signaalien vahvistamista, modulaatiota ja transduktiota välittäviin signaalireitteihin sekä patogeenien poistamista isännästä välittäviin efektorimekanismeihin (Baton ym., 2008). RNAi on itsessään merkittävä virusinfektioiden vastainen immuunimekanismi hyttysissä. RNA-pohjaisessa antiviraalisessa immuniteetissa hyttysen Dicer tunnistaa viruksen dsRNA:n ja prosessoi sen siRNA:ksi. Tämän jälkeen nämä viruksesta peräisin olevat siRNA:t ohjaavat spesifistä antiviraalista immuniteettia RNAi:n ja siihen liittyvien RNA-vaimennuksen efektorimekanismien avulla (Ding, 2010). Lukuisissa artikkeleissa raportoidaan RNAi:n käytöstä hyttysten immuunigeenien toiminnan karakterisoimiseksi. Yleisiä immuunimekanismeja ja efektoreja koskevissa tutkimuksissa on keskitytty hahmontunnistusreseptoreihin, antibakteerisiin ja antifungaalisiin signaalireitin molekyyleihin ja proteiineihin, jotka osallistuvat muihin solujen efektomekanismeihin (katsaus teoksessa Dong ym., 2006; Moita ym., 2005; Shin ym., 2003, 2006; Wang ym., 2006).
RNAi:tä on käytetty myös hyttysen ja taudinaiheuttajan välisen rajapinnan luonnehtimiseen, ja monissa tutkimuksissa on tarkasteltu immuniteettiin liittyviä hyttysen molekyylejä. Molekulaariset vuorovaikutukset hyttysen ja patogeenin rajapinnassa varmistavat sekä patogeenin että vektorin selviytymisen ja kehityksen. Siksi patogeenien ja niiden hyttysvektorien välisten molekulaaristen vuorovaikutusten ymmärtäminen on olennaisen tärkeää uusien torjuntatoimenpiteiden kehittämiseksi. Viime vuosikymmenen aikana on tehty intensiivistä tutkimusta patogeenien aiheuttamiin immuunivasteisiin osallistuvien hyttysgeenien tunnistamiseksi ja toiminnalliseksi luonnehtimiseksi käyttäen erilaisia lähestymistapoja, kuten vertailevaa genomiikkaa, transkriptioprofilointia ja RNAi-pohjaista funktionaalista analyysia (Baton et al., 2008). Näissä ponnisteluissa on keskitytty pääasiassa kahteen hyttynen-patogeeniyhdistelmään, A. gambiae-Plasmodium sp. ja A. aegypti-denguevirus 2 (DENV-2). Fragkoudis ym. (2009) on tarkastellut yksityiskohtaisesti hyttysen synnynnäisiä immuunivasteita arbovirusinfektioita vastaan, ja Brown ja Catteruccia (2006) sekä Baton ym. (2008) ovat hiljattain tarkastelleet hyttysen synnynnäisiä immuunivasteita malariaparasiitteja vastaan, mukaan luettuina RNAi-lähestymistavat.
Useimmissa näissä RNAi:iin perustuvissa tutkimuksissa on tähdätty pikemminkin hyttysen immuunipuolustusmekanismiin kuuluviin geeneihin kuin niihin geeneihin, joita taudinaiheuttajat tarvitsevat kehittyäkseen hyttysvektorissa. Mitä tulee RNAi knock-downin kohteena olleisiin hyttysten malarialisoitumista estäviin geeneihin, suurin osa niistä on sellaisia, jotka osallistuvat ookineettien tappamiseen ja melanisaatioon keskisuoleen tunkeutumisen aikana (katsaus teoksessa Brown ja Catteruccia, 2006; Baton et al., 2008). Niistä hyttysten antiviraalisista geeneistä, joille on tehty knock-down, osa on signaalireittien komponentteja, kun taas toiset ovat osa RNAi-pohjaista antiviraalista puolustusta (katsaus Fragkoudis ym., 2009).
Uudemmista artikkeleista Guo ym. (2010) esittelevät käyttökelpoisen lähestymistavan, jonka avulla voidaan tunnistaa uusia DENV-2:n kanssa vuorovaikutuksessa olevia A. aegypti -proteiineja. Nämä kirjoittajat kehittivät ensimmäisen luonnoksen hyttysproteiinien vuorovaikutusverkostosta käyttämällä laskennallista lähestymistapaa ja tunnistivat 714 oletettua DENV:hen liittyvää A. aegypti -proteiinia, jotka ryhmittyvät neljään toiminnalliseen pääluokkaan (replikaatio/kirjoitus/transkriptio, immuniteetti, kuljetus ja aineenvaihdunta). Kymmenen näistä oletetuista DENV:hen liittyvistä proteiineista valittiin satunnaisesti validoitavaksi RNAi-välitteisellä geenien vaimentamisella, ja viidellä niistä dengueviruksen titteri hyttysen välikarsinassa väheni merkittävästi.
Kokonaisuutena nämä tulokset tukevat käsitystä siitä, että RNAi voisi olla tehokas väline hyönteisten tautivektoreiden immuunijärjestelmän korkean läpimitan karakterisoinnissa, mikä edistäisi mahdollisten hyttyskohteiden tunnistamista ja karakterisointia hyttyspopulaatioiden, hyttysten sisällä olevien loisten ja hyttysten levittämien tautien hallintaan käytettävien uusien menetelmien kehittämiseksi.
Sen jälkeen, kun havaittiin, että RNAi on yksi hyttysen tärkeimmistä puolustautumiskeinoista arboviruksia vastaan, on raportoitu, että tämän reitin tukahduttaminen lisää viruskuormitusta tartunnan saaneissa hyttysissä (Sanchez-Vargas ym, 2009). Cirimotich ym. (2009) käyttivät Sindbis-virusta, joka on muokattu ilmentämään proteiinia, joka sitoutuu dsRNA:han ja oletettavasti suojaa sitä prosessoinnilta RNAi-reitillä ja toimii siten RNAi-suppressorina. Tämä muokattu virus tuottaa tartunnan saaneissa hyttysissä paljon normaalia enemmän viruspartikkeleita ja on tappava useille hyttyslajeille (A. aegypti, Aedes albopictus, C. trithaeniorhynchus). Tämä lähestymistapa on esimerkki uudesta genetiikkaan perustuvasta kehityksestä, josta voi olla hyötyä hyttysten torjuntaan tähtäävissä “populaatioiden tukahduttamisstrategioissa” (Alphey, 2009).
Myös päinvastaista tavoitetta, eli RNAi-pohjaisen virusperäisen hyttysimmuniteetin keinotekoista vahvistamista viruskestävien hyttysten saamiseksi, on kehitetty. Antiviraalista RNAi:tä on käytetty antamaan resistenssi DENV:tä vastaan siirtogeenisille A. aegypti -hyttysille ilmentämällä hiusneula-RNA:ta, joka vastaa viruksen fragmenttia (Franz ym., 2009). Kudos- ja aikaspesifisten promoottoreiden avulla hiusnauha-RNA:n ilmentyminen voidaan rajoittaa keskisuoleen – ensimmäisiin infektoituviin soluihin – ja vasta veriaterian jälkeen, jolloin minimoidaan pitkän hiusnauha-RNA:n konstitutiivisesta ilmentymisestä hyttysen kuntoon mahdollisesti aiheutuvat ongelmat. Keskustelua tämäntyyppisten siirtogeenisten resistenttien hyttyskantojen käytön eduista ja ongelmista hyttystorjunnan “populaatiokorvausstrategioissa” on Alpheyssä (2009).