1960-luvulla saavutettiin kaksi virstanpylvästä suoliston sokerin imeytymisen fysiologiassa. Ensimmäinen oli Cranen ja kollegoiden Na+-glukoosin yhteiskuljetushypoteesi (1), joka selitti aktiivisen sokerin kuljetuksen, ja toinen oli glukoosin ja galaktoosin imeytymishäiriön (GGM) löytyminen potilailla (5, 6). Kotransporttihypoteesia on testattu perusteellisesti, vahvistettu ja laajennettu kattamaan monenlaisten substraattien “aktiivinen kuljetus” soluihin aina laktoosin kertymisestä Escherichia coli -bakteeriin ja jodidin kertymiseen kilpirauhaseen. Pohjimmiltaan kotransporterit ovat molekyylikoneita, jotka käyttävät solukalvojen läpi kulkevien ionien sähkökemiallisiin potentiaaligradientteihin varastoitunutta energiaa, Na+ tai H+, ajaakseen tiettyjen liuottimien ja veden kertymistä soluihin (22). Suoliston Na+-glukoosikotransporteri (SGLT1) käyttää Na+:a ja kalvon yli kulkevaa sähköistä gradienttia ajaakseen sokeria ja vettä enterosyytteihin niiden pitoisuusgradienttia vastaan (9, 13, 23). SGLT1 käsittelee sekä glukoosia että galaktoosia, kun taas fruktoosia kuljettaa harjasrajan yli sen oma kuljettaja, helpotettu fruktoosikuljettaja (GLUT5). Glukoosi, galaktoosi ja fruktoosi viimeistelevät matkansa solun läpi vereen toisen basolateraalisella kalvolla olevan fasilitoidun sokerikuljettajan (GLUT2) välityksellä (kuva 1).

GGM:lle on ominaista vastasyntyneenä alkava vetinen ja hapan vaikea ripuli, joka johtaa kuolemaan muutamassa viikossa, ellei laktoosia (glukoosia ja galaktoosia) poisteta ruokavaliosta (2). Ripuli lakkaa, kun ruokavaliota paastotetaan tai haitalliset sokerit poistetaan ruokavaliosta, mutta se jatkuu nopeasti, kun ruokavaliota, joka sisältää laktoosia, glukoosia tai galaktoosia, annetaan suun kautta. Fruktoosin imeytyminen ei vaikuta. Kun otetaan huomioon taudin oireet ja se, mitä tuolloin tiedettiin suoliston sokerin imeytymisestä, ennustettiin, että GGM johtui harjan reunan Na+-glukoosikotransporterin viasta. Tätä hypoteesia vahvistivat ensimmäisen amerikkalaisen GGM-potilaan limakalvobiopsioista tehdyt hienot autoradiografiset galaktoosinotto- ja floritsiinin sitoutumiskokeet (17, 18). Nämä kokeet osoittivat, että galaktoosin kuljetuksen vähenemiseen liittyi 90 prosentin vähennys floritsiinin sitoutumisessa harjasrajaan. Kloritsiini on spesifinen, ei-kulkeutuva, kilpaileva SGLT1:n estäjä.

Luotettavin diagnostinen testi GGM:lle on H2-hengitystesti (kuva 2). Glukoosin tai galaktoosin (2 g/kg) antaminen suun kautta johtaa GGM-potilailla hengityksen H2-arvon nousuun huomattavasti yli 20 osaan/miljoona, mutta ei tällaista nousua kontrolleissa tai fruktoosia saaneilla potilailla. GGM:ää sairastavat lapset menestyvät “normaalisti” fruktoosikorvausvalmisteilla, mutta oireet palaavat jopa aikuisiässä jo pienellä teelusikallisella glukoosia (6 g), ja H2-hengitystesti pysyy positiivisena. Tauti on melko harvinainen. Tiedossamme on noin 200 potilasta maailmanlaajuisesti, ja suuri osa tapauksista on peräisin sukulaisuussuhteista.

Suolensisäisen sokerin imeytymisen fysiologiaa ja patofysiologiaa edistettiin vuonna 1987 kloonaamalla kanin Na+-glukoosin kolotransporteri uudenlaisella strategialla, jota kutsuimme nimellä “ekspressiokloonaus”. Tätä menestystä seurasi nopeasti ihmisen Na+-glukoosikotransporterin kloonaus (4), jonka Turk ja Hediger suorittivat, sekä ensimmäisen sellaisen transporterin mutaation tunnistaminen, joka aiheutti geneettisen sairauden, GGM:n (20). Saimme suolistobiopsiat kahdelta sisarukselta, joilla oli diagnosoitu GGM, ja verinäytteet vanhemmilta, jotka ovat serkkuja. Turk et al. (20) tunnistivat homotsygoottisen missense-mutaation (Asp28Asn) kummankin siskon SGLT1-cDNA:ssa, totesivat, että kumpikin vanhempi oli tämän mutaation kantaja, ja osoittivat, että mutaatio todellakin poisti Na+-glukoosin kolotransportaation täydellisesti munasolujen ekspressiotestillä. Samassa suvussa tehtiin sittemmin kahdelle sikiölle prenataalinen seulonta, ja toisen (koehenkilön sisaruksen) todettiin olevan Asp28Asn-mutaation kantaja ja toisen (serkun) todettiin olevan normaali. Molemmat lapset ovat menestyneet hyvin ilman ruokavaliorajoituksia ja pysyneet oireettomina ainakin kahden vuoden ajan (11).

Jatkokehitystä haittasi aluksi vaikeus saada limakalvobiopsia-näytteitä lapsilta, joilla oli GGM, kunnes Turk et al. (21) onnistuivat kartoittamaan koko ihmisen SGLT1-geenin. Geeni on suuri, ja siinä on 15 eksonia, jotka jakautuvat 72 kb:n DNA:n alueelle. Kun eksonit ja niitä reunustavat alueet oli sekvensoitu, kehitettiin yksijuosteinen konformaatiopolymorfismimääritys, jolla voidaan seuloa potilaita mutaatioiden varalta pienestä verinäytteestä otetun genomisen DNA:n avulla. Tähän kehitystyöhön kuului kunkin 15 eksonin ja niiden introni-eksoniliitosten PCR-monistaminen ja denaturoitujen PCR-tuotteiden geelielektroforeesi mutaatioita sisältävien eksonien tunnistamiseksi. Poikkeavat eksonit sekvensoitiin. Sen määrittämiseksi, olivatko mutaatiot vastuussa sokerin kuljetusvirheestä, mutantit ekspressoitiin Xenopus laevis -okosyyteihin Na+-glukoosin ottotestejä varten. Martı́n (viitteet 10, 12 ja julkaisemattomat havainnot) vastasi suurelta osin hankkeen tästä vaiheesta. Taudin aiheuttavat mutaatiot tunnistettiin 33:lla tutkituista 34 GGM-potilaasta. Potilailla 17 suvussa oli homotsygoottisia mutaatioita, ja 10 muussa suvussa potilailla oli yhdistelmäheterotsygoottisia mutaatioita. Näihin kuului 22 missense-mutaatiota (ks. kuva 3) sekä 4 splice-site- ja 3 nonsense-mutaatiota, jotka johtavat voimakkaasti typistyneen SGLT1-proteiinin tuottamiseen. Se, että 34. potilaan mutaatioita ei havaittu, voi johtua siitä, että mutaatio sijaitsi geenin promoottorin alueella, eikä tältä alueelta peräisin olevaa DNA:ta otettu mukaan seulontaan.

Kuljetusfysiologina olen ollut kiinnostunut GGM missense -mutaatioista, koska niiden avulla on mahdollista tunnistaa kuljetuksen kannalta kriittisiä proteiinin jäänteitä. Siksi lähdimme selvittämään, miten missense-mutaatiot todella aiheuttavat vian Na+-sokerin kuljetuksessa. Tässä lähestymistavassa, jonka suurelta osin toteutti Lostao (ks. viitteet 10 ja 12), mutanttiproteiinit ekspressoitiin X. laeviso -soluissa, minkä jälkeen käytettiin biofysikaalisia ja biokemiallisia menetelmiä proteiinin määrän määrittämiseksi solussa ja plasmakalvossa. Tapauksissa, joissa kuljettaja oli sijoitettu plasmakalvoon, me (7) tutkimme kuljetussyklin osareaktioita. Olimme aluksi pettyneitä havaitessamme, että ensimmäisten 21 tutkittujen missense-mutanttien kohdalla ensisijainen vika johtui siirtäjien virheellisestä kulkeutumisesta solussa. Western blottien perusteella kaikki mutantit syntetisoituivat samankaltaisilla tai korkeammilla tasoilla kuin villityyppinen SGLT. Kuitenkin munasolun plasmakalvon varausmittaukset (7) ja pakkasfraktuurielektronimikroskopia (24) osoittivat, että plasmakalvossa olevien cotransporterien määrä oli voimakkaasti vähentynyt (10, 12). Mutanttien ydin- ja kompleksiglykosylaatioasteen perusteella voidaan päätellä, että SGLT1:n siirtyminen plasmakalvoon tapahtui joko endoplasmisen retikulumin ja Golgin tai Golgin ja plasmakalvon välillä. Mutanttiproteiinien vääränlainen taittuminen voi olla ensisijainen syy transporterin missortoitumiseen (19). Vain yhdessä tapauksessa, Gln457Arg, mutanttiproteiini oli munasolun plasmakalvolla lähellä normaalia tasoa.

Mitä merkitystä näillä munasoluilla tehdyillä kokeilla on GGM-potilaiden suolistoon? Vastataksemme tähän tutkimme (julkaisemattomat tiedot) SGLT1-proteiinin jakautumista immunosytokemiallisesti kolmen homotsygoottista mutaatiota sairastavan potilaan limakalvobiopsioissa. Kaikilla kolmella mutanttiproteiinien jakauma oli identtinen SGLT1:n jakauman kanssa potilaan enterosyyteissä: kahdella proteiini oli sytoplasmassa, ja yhdellä proteiini oli harjasreunassa. Myös munasoluista saamiemme tulosten ja ensimmäisen amerikkalaisen GGM-potilaan biopsioista tehdyissä autoradiografisissa tutkimuksissa saatujen tulosten välillä on yhdenmukaisuus (18). Stirling ja hänen työtoverinsa (18) havaitsivat, että floritsiinin sitoutuminen potilaan harjasrajaan oli vähentynyt 90 %:lla, ja me emme löytäneet mutaattista SGLT1-proteiinia (Cys355Ser ja Leu147Arg) munasolujen plasmakalvolta (10). Nämä tutkimukset viittaavat siihen, että ainakin näillä neljällä GGM-mutaatiolla oosyytti toistaa mutanttiproteiinin käyttäytymisen enterosyytissä.

Suuri jäljellä oleva kysymys on, miten proteiiniin jakautuneet missense-mutaatiot (kuva 3) häiritsevät transporterin kulkeutumista plasmakalvoon. Vastaukset tähän kysymykseen ovat tärkeitä plasmakalvoproteiinien biosynteesin ymmärtämisessä ja parempien hoitomuotojen suunnittelussa GGM:ää sairastaville lapsille.

Yhden sukulaislajin GGM-mutaatio Gln457Arg on tarjonnut korvaamatonta tietoa sokerinsiirron mekanismista. Lostao tutki (valmisteilla) munasoluissa ja potilaan suolen limakalvolla ekspressoidun Q457R SGLT1:n käyttäytymistä ja havaitsi, että proteiini translatoituu, glykosyloituu ja asettuu plasmakalvoon, mutta se ei pysty kuljettamaan sokeria. Sokerin puuttuessa mutanttiproteiini kuljettaa Na+:aa Na+ -vuodon tai Na+ uniport -reitin kautta, ja tämä estyy floritsiinilla. Glukoosi on myös inhibiittori, koska se estää myös tämän Na+ -kuljetusreitin, mikä osoittaa, että glukoosi sitoutuu Q457R SGLT1:een, mutta sitä ei kuljeteta, eli mutaatio tuottaa sokerin translokaatiovian. Panayotova-Heiermann ja kollegat (15) osoittivat itsenäisesti, että SGLT1:n läpi kulkevan sokerin “huokosen” muodostaa SGLT1:n COOH-terminaalinen domeeni, jossa on jäännös Q457.

Hyödyntääksemme näitä havaintoja olemme tutkineet Q457:n roolia sokerin translokaatiossa. Tässä tutkimuksessa havaittiin, että kysteiinimutantti Q457C säilytti täyden Na+-glukoosin kuljetusaktiivisuuden lukuun ottamatta glukoosin näennäisen glukoosin Michaelis-Menten-vakion (Km) nousua 0,4:stä 6 mM:iin, ja Q457C:n kemiallisen mutageneesin joko varatuilla tai neutraaleilla alkyloivilla reagensseilla (metaanitiosulfonaatit, MTS) havaittiin estävän sokerin kuljetuksen täysin. Koska alkyloitu Q457C-proteiini kuitenkin sitoo glukoosia dissosiaatiovakiolla, joka on hyvin samankaltainen kuin Q457C SGLT1:n sokerinkuljetuksen näennäinen Km, tämä jäännös ei saa olla osa sokerin sitoutumiskohtaa. Q457C:n sokerinkuljetuksen estyminen MTS:llä tapahtui vain silloin, kun rinnakkaiskuljettaja oli ulospäin suuntautuneessa Na+-konformaatiossa, C2 (kuva 4). Reagenssi ei vaikuttanut Na+:n puuttuessa, Na+:n ja glukoosin (tai floritsiinin) läsnä ollessa eikä Na+:n läsnä ollessa depolarisoituneilla kalvopotentiaaleilla. Jännitehyppykokeet, joissa käytettiin rhodamiinilla leimattua Q457C:tä, osoittivat myös, että fluoresenssin aikakäyrä ja taso seurasivat tiiviisti kolotransporterin siirtymistä konformaatioiden C2 ja C6 välillä (kuva 4). Tulkitsemme näiden tulosten tarkoittavan, että kootransporteri voi esiintyä ainakin kolmessa eri konformaatiossa (C6, C2 ja C3) ja että Na+- ja sokerikuljetuksen välinen kytkentä tapahtuu ligandin ja jännitteen aiheuttamien konformaatiomuutosten kautta proteiinissa.

Alustavat tutkimukset kahdella muulla GGM-missense-mutaatiolla SGLT1:n COOH-terminaalisessa domeenissa, A468V:llä ja R499H:lla (kuva 3), osoittavat, että jäännösten korvaaminen kysteiineillä palauttaa proteiinin kulkeutumisen munasolujen plasmamembraaniin. Molemmat proteiinit ovat toimivia, ja sokerin kuljetus estyy MTS-reagensseilla. Kuten Q457C:n tapauksessa, nämä jäännökset ovat MTS-reagenssien käytettävissä vain silloin, kun proteiinit ovat C2-konformaatiossa. Nämä tulokset tukevat näkemystäni siitä, että transmembraanihelikit 10-13 (kuva 3) muodostavat sokerihuokosen. Na+ -huokosen tunnistamiseksi tarvitaan lisätyötä.

Yhteenvetona voidaan todeta, että SGLT1:n molekyylibiologiset tutkimukset ovat johtaneet ihmisen SGLT1:n cDNA:n kloonaamiseen ja geenin kartoittamiseen, mikä on tarjonnut tehokkaita uusia välineitä Na+-glukoosin yhteiskuljetuksen fysiologian tutkimiseen ja GGM:n tutkimiseen. GGM:n on vahvistettu johtuvan SGLT1-geenin mutaatioista, ja useimmat näistä mutaatioista johtavat joko typistettyyn SGLT1-proteiiniin tai transporterin virheelliseen siirtymiseen solussa. Kuten autosomaalisessa resessiivisessä taudissa on odotettavissa, yksityinen mutaatio aiheuttaa taudin jokaisessa sukulaisuussuhteessa, ja taudin esiintymistiheys kasvaa kulttuureissa, joissa on paljon sukulaisavioliittoja. Vaikka GGM on harvinainen, on mahdollista, että suuremmalla joukolla henkilöitä, jotka kantavat lieviä SGLT1-mutaatioita tai vakavia mutaatioita yhdessä alleelissa, glukoosin ja galaktoosin imeytyminen on heikentynyt. Noin 10 % normaaliväestöstä, lääketieteen opiskelijoista, antoi positiivisen glukoosin H2-hengitystestin (14). Tämä fysiologian ja sairauden välinen rajapinta ei ole ainoastaan lisännyt ymmärrystä sokerin imeytymisen patofysiologiasta, vaan se on myös tarjonnut uusia lähestymistapoja Na+ – ja sokerin kuljetuksen välisen kytkennän molekyylimekanismien tutkimiseen plasmakalvojen läpi.

FOOTNOTES

• * Ensimmäinen sarjaan kutsutuista artikkeleista, jotka käsittelevät geneettisiä kalvokuljetushäiriöitä.