3.1 Enzymes endogènes des poissons
Comme nous l’avons vu précédemment, diverses enzymes protéolytiques sont présentes dans les viscères, le tube digestif et les tissus musculaires des poissons.
Les principales protéinases endogènes des anchois étaient la protéinase de type trypsine, la pepsine, la chymotrypsine, l’élastase et l’aminopeptidase (Martinez & Serra, 1989 ; Siringan, Raksakulthai, & Yongsawatdigul, 2006). Les enzymes digestives de trypsine, chymotrypsine et pepsine sont considérées comme les trois enzymes les plus importantes par rapport aux autres (de la Parra, Rosas, Lazo, & Viana, 2007). La pepsine est généralement présente dans l’estomac des poissons et est une enzyme principale des sucs digestifs (de la Parra et al., 2007). La trypsine est présente dans les viscères, le caeca pylorique et la rate (Kishimura, Hayashi, Miyashita, & Nonami, 2005, 2006 ; Kishimura et al., 2007 ; Klomklao et al., 2006). L’hépatopancréas des organes digestifs des poissons et des crustacés contient à la fois des activités de peptidase et de protéinase telles que l’aminopeptidase, les protéases gélatinolytiques, la trypsine et la chymotrypsine, et les protéases collagénolytiques (Sriket, 2014).
Il a été constaté que la plupart des activités de lipolyse et de protéolyse dans la transformation de la péda ont été enregistrées dans l’intestin, en particulier au début du processus de fermentation ; cependant, les activités ont chuté rapidement au cours du processus (Irianto, 1990). Étant donné que les enzymes se trouvent dans les viscères et le tube digestif, l’éviscération joue un rôle important dans la détermination du taux et du type de dégradation enzymatique qui se produit. Les produits de poisson fermentés traités en utilisant le poisson entier auront des caractéristiques différentes de celles des produits fabriqués à partir de poissons étêtés et éviscérés (Wheaton & Lawson, 1985). L’activité enzymatique de la plupart des enzymes viscérales et du tube digestif des poissons avait la plus grande activité à des valeurs de pH presque neutres (Bougatef et al., 2007 ; Munilla-Moran & Saborido-Rey, 1996).
Castillo-Yañez, Pacheco-Aguilar, Garcia-Carreño, et Toro (2004) ont isolé une enzyme protéolytique acide, qui appartient à la classe des protéases aspartiques à partir des viscères de sardines. L’enzyme est similaire à la pepsine II d’autres espèces de poissons et est stable à pH 3-6 et à 45°C.
Les caecums pyloriques représentent les organes qui sont la source majeure de protéases alcalines. Une enzyme semblable à la trypsine obtenue à partir du caecum pylorique de la morue (G. morhua) avait un point isoélectrique de 5,30 et 5,89 et était très similaire en composition d’acides aminés à la trypsine bovine, mais différait en ayant une quantité relative plus élevée d’acides aminés acides et une quantité plus faible d’acides aminés basiques. L’enzyme a également hydrolysé des substrats de protéines de poisson (Beirão, Mackie, Teixeira, & Damian, 2001).
Trois protéases alcalines et deux protéases acides ont été isolées de la sardine. Chacune des protéinases alcalines a hydrolysé la caséine plus rapidement que les autres protéines. Une protéinase alcaline majeure (III) a hydrolysé les protéines sarcoplasmiques de la sardine cinq fois plus rapidement que les autres protéinases alcalines. Chacune de deux protéinases acides a hydrolysé l’hémoglobine et la myoglobine plus rapidement que les autres protéines. Après préincubation avec du NaCl à 25 %, une protéinase alcaline (III) et une protéinase acide (II) sont restées stables alors que les autres protéinases sont devenues instables. Les deux protéinases, la protéinase alcaline III et la protéinase acide II, étaient également stables pendant 3 mois après le début de la production de sauce de poisson. L’activité protéolytique de chacune des protéinases alcalines et de la protéinase acide a été fortement inhibée par plus de 15 % de NaCl ; cependant, une inhibition minimale a été observée lorsque les protéines musculaires de sardine ont été utilisées comme substrat (Noda, Van, Kusakabe, & Murakami, 1982).
Deux aminopeptidases (I et II) ont été extraites d’organes internes dégraissés de sardine et purifiées par chromatographie DEAE-cellulose, filtration sur gel sur Sephadex G-200 et focalisation isoélectrique. Les préparations finales des enzymes I et II ont été jugées presque homogènes par électrophorèse sur gel de polyacrylamide. Les poids moléculaires des enzymes I et II ont été déterminés par filtration sur gel comme étant de 370 000 et 320 000, respectivement. Les points isoélectriques étaient de 4,1 (I) et 4,8 (II), respectivement. Les deux enzymes ont été inhibées par l’EDTA et activées par le Co++. La bestatine a pu inhiber l’enzyme I mais pas l’enzyme II. Les enzymes I et II ont rapidement hydrolysé non seulement les substrats synthétiques contenant de l’alanine ou de la leucine, mais aussi la di-, tri- et tétra-alanine. D’après toutes ces caractéristiques, les aminopeptidases de sardine ressemblent à l’alanine aminopeptidase humaine. L’enzyme I a conservé plus de 70 % de son activité initiale dans 15 % de NaCl, ce qui suggère que l’enzyme participe à l’hydrolyse des protéines et des peptides de poisson pendant la production de sauce de poisson (Vo Van, Kusakabe, & Murakami, 1983).
Les activités des protéinases alcalines et acides ont été comparées à celles de la trypsine et de la pepsine bovines et ont montré que, comme la trypsine bovine, la protéinase alcaline du caecum pylorique des sardines hydrolysait la caséine plus efficacement que les autres substrats protéiques (Noda et al, 1982).
Les enzymes du tissu musculaire, notamment les cathepsines, les peptidases, les transaminases, les amidases, les décarboxylases d’acides aminés, les déshydrogénases glutamiques et les enzymes apparentées, sont toutes présentes dans le tissu musculaire des poissons (Chaveesuk, 1991), et ces enzymes, notamment la trypsine, la chymotrypsine et la cathepsine, participent à l’hydrolyse des protéines pendant la fermentation de la sauce de poisson (Fernandes, 2016). Les enzymes des tissus musculaires sont principalement situées dans les cellules. En revanche, les enzymes digestives sont des sécrétions exocellulaires. Même si certaines études ont montré que les enzymes du tissu musculaire ont une activité optimale à pH neutre, la plupart des rapports indiquent que les valeurs de pH faibles accélèrent les activités des enzymes du tissu musculaire. La plupart des produits de poisson fermentés sont traités à un pH supérieur à 4, à l’exception de l’ensilage de poisson et de certains produits de poisson fermentés. Par conséquent, la plupart des enzymes du tissu musculaire ne sont en fait pas dans une condition de pH optimale (Mackie et al., 1971).
La caractérisation partielle des cathepsines B du muscle du chinchard a indiqué des caractéristiques similaires aux autres cathepsines BS. Le pH optimal de la cathepsine était de 5 avec une température optimale de 50°C. L’activité a été inhibée par l’E-64, le CA-074 et la chymostatine (Yoshida et al., 2015).
Les activités enzymatiques maximales peuvent être obtenues en utilisant des poissons entiers, y compris les têtes et les viscères. Au contraire, une activité enzymatique minimale se produira lorsque des poissons décapités et éviscérés sont utilisés pour produire des produits de poisson fermentés. Pendant ce temps, des activités enzymatiques intermédiaires peuvent être obtenues en retirant les viscères à tout moment après la capture du poisson pour permettre une certaine diffusion des enzymes viscérales dans les tissus (Owens &Mendoza, 1985).
Dans le poisson salé, la maturation est décrite par trois hypothèses. Ce sont (1) la théorie microbiologique, (2) la théorie autolytique, et (3) la théorie des enzymes. Dans la théorie microbiologique, les micro-organismes produisent les enzymes actives essentielles, et ces enzymes pénètrent dans la chair et contribuent au processus de maturation. La théorie autolytique décrit que le mûrissement est le résultat de l’activité des enzymes des muscles ou d’autres tissus, ou du tractus gastro-intestinal. Enfin, la théorie enzymatique explique le mûrissement du poisson salé comme ayant lieu sous l’influence de certaines enzymes, à savoir celles contenues dans le tissu musculaire, celles des organes du corps intestinal du poisson, ainsi que celles produites par les micro-organismes (Mackie et al., 1971).
Dans la maturation des anchois, l’activité autolytique maximale de l’anchois indien (Stolephorus indicus) a été trouvée à 60°C. L’activité autolytique a diminué avec l’augmentation de la concentration de NaCl. L’extrait brut a présenté un pH optimal à 8,5-9,5. Les protéinases de type trypsine étaient les protéinases prédominantes dans l’extrait brut. Les protéinases de l’anchois indien pourraient participer à l’hydrolyse des protéines pendant la fermentation de la sauce de poisson. Par conséquent, l’incubation des anchois indiens à 60°C et dans 10% de NaCl pendant un certain temps avant le salage complet à 25% de NaCl pourrait être un moyen efficace d’accélérer le processus de fermentation de la sauce de poisson (Siringan et al., 2006).