Le Dr Bang était très intéressé par les systèmes circulatoires des invertébrés. Il pensait que l’étude des animaux chez lesquels la circulation pouvait être observée permettrait de mieux comprendre les processus physiologiques des vertébrés, comme les humains.
Au début des années 1950, alors qu’il était au laboratoire de biologie marine de Wood’s Hole, dans le Maine, Bang a étudié le système circulatoire de la limule et sa réaction à une infection bactérienne.
Il injectait des bactéries obtenues à partir d’eau de mer fraîche dans des limules de tailles différentes et étudiait leur réaction. Habituellement, le sang formait un petit caillot pour sceller la zone infectée et empêcher toute autre bactérie de pénétrer.
Mais un jour, Bang a remarqué qu’un de ses crabes était mort d’une infection inconnue qui avait provoqué la coagulation de presque tout le volume de sang du crabe en une masse semi-solide.
Cela n’avait jamais été observé auparavant!
Il a donc isolé et cultivé la bactérie du premier animal et l’a injectée à d’autres limules. Ils ont également connu une coagulation identique et sont morts.
En poussant ses investigations, il a découvert que seules les bactéries “Gram-négatives” produisaient cette réaction.
Note: In 1884, Hans Christian Gram invented a staining procedure for microscopy which came to be called The Gram stain. It stains the bacteria either red (Gram-negative) or violet (Gram-positive) depending on the chemicals they have in their cell walls.
Les bactéries Gram-négatives provoquent des infections telles que la pneumonie et la méningite. Lorsque Bang a tué par la chaleur les bactéries avant l’injection, il a toujours obtenu la même réaction de coagulation. Cela signifiait que les bactéries vivantes n’étaient pas nécessaires pour provoquer la coagulation du sang de la limule.
Il a publié ses résultats en 1956 et a mis de côté ses observations initiales pendant près de 10 ans.
Entrez Jack Levin.
En 1963, alors que Bang discutait des données de son projet sur la limule, un collègue suggéra qu’une collaboration avec un hématologue pourrait aider à élucider le mystère de la coagulation. Le collègue a recommandé un chercheur de son laboratoire, le Dr Jack Levin.
Levin utilisait des lapins pour étudier la réaction de Shwartzman – la réaction aux endotoxines qui provoque la formation d’un caillot à l’intérieur d’un vaisseau sanguin et altère également la fonction des plaquettes des vertébrés.
L’endotoxine est un composant clé de la paroi cellulaire de toutes les bactéries Gram-négatives ; elle peut être difficile à détecter et est résistante aux médicaments.
Bang a persuadé Levin de passer un été au laboratoire de biologie marine de Woods Hole où il a étudié les similitudes entre les amébocytes de Limulus et les plaquettes humaines.
Il a rapidement démontré que le plasma exempt de cellules d’une limule ne coagulait pas, mais lorsqu’il étudiait les cellules sanguines, il avait du mal à empêcher le sang de coaguler.
Il avait aussi un autre problème. Des échantillons qui allaient bien quand il quittait le laboratoire le soir étaient coagulés quand il revenait le matin, et aucun des anticoagulants sur le marché ne faisait de différence.
La sérendipité mène à un Aha ! Moment
Levin était déconcerté et il commençait à être un peu désespéré pour comprendre cela !
Peut-il être dû à des bactéries ou à un composant de bactéries ?
Pour tester cette possibilité, il a préparé de nouveaux échantillons dans des verres stériles, sans endotoxines. Étonnamment, le sang ne coagulait pas !
C’est alors qu’il s’est rendu compte qu’il avait identifié un mécanisme de coagulation du sang qui était déclenché par la présence d’endotoxine bactérienne gram-négative.
Enfin, il a pu montrer que l’ensemble du mécanisme de coagulation du sang chez Limulus était contenu dans les amébocytes et était extrêmement sensible à la présence d’endotoxines.
Amébocytes de Limulus polyphemus
“Je pense que seul un investigateur qui travaillait avec de l’endotoxine aurait envisagé la possibilité que l’endotoxine fasse coaguler le sang de Limulus”, dit Levin.
C’est ce qui a conduit Levin à créer et à breveter le test extrêmement sensible du lysat d’amébocyte de Limulus (LAL), qui permettait de tester les endotoxines bactériennes en utilisant le sang de limule.
Le seul autre test pour les endotoxines à l’époque était appelé le test pyrogène de lapin. À l’époque, la Food and Drug Administration américaine exigeait que tous les médicaments injectables passent le test pyrogène avant que leur utilisation ne soit approuvée.
Cependant, le test pyrogène du lapin était un processus coûteux, inefficace et souvent inexact.
Vous injectez l’échantillon dans un groupe de lapins. Si ces lapins ont de la fièvre, le médicament a échoué au test. S’ils n’ont pas eu de fièvre dans les 4 à 6 heures, le médicament a réussi.
Les sociétés pharmaceutiques devaient héberger des milliers de lapins pour effectuer ces tests.
Le test LAL peut renvoyer un résultat en 45 minutes seulement et peut détecter la présence d’endotoxines à des niveaux inférieurs à une partie par trillion.
Levin a réalisé qu’il avait un test très sensible et rapide ! C’était une rude concurrence pour le test du lapin.
Le test LAL peut renvoyer un résultat en aussi peu que 45 minutes et peut détecter la présence d’endotoxines à des niveaux inférieurs à une partie par trillion.
Bien que le test LAL ait été décrit pour la première fois en 1965, il a fallu près de 20 ans avant que le test ne soit officiellement approuvé comme un test d’endotoxines de produits finis par la FDA !
Pourquoi cela a-t-il pris autant de temps ?!
Connaissons-le, les gens n’aiment pas changer les choses et les entreprises résistent vraiment au changement. Adopter le nouveau test, plus sensible, signifiait que les entreprises pharmaceutiques devaient se réoutiller et mettre en place une toute nouvelle ligne de production.
C’est du temps et de l’argent !
Mais la crème finit par monter au sommet ; ce test était la crème de la crème et l’est toujours !
La demande pour le LAL est maintenant si élevée qu’il est devenu l’un des liquides les plus précieux sur Terre, avec un prix rapporté en avril 2018 entre 35 000 et 60 000 dollars par gallon !
Mise à l’échelle du test LAL
Le test LAL a été désigné comme l’une des “100 contributions les plus importantes à la santé publique” par l’école de santé publique Johns Hopkins Bloomberg.
Selon Jack Levin, il s’agit du test de dépistage standard de la contamination par les endotoxines dans le monde entier, avec environ 17,5 millions d’échantillons testés (soit environ 70 millions de tests effectués) chaque année. Il est utilisé commercialement pour tester tous les fluides intraveineux, les médicaments parentéraux et les dispositifs médicaux implantables avant qu’ils ne soient utilisés chez les patients.
Comment fabrique-t-on le LAL ?
Les limules sont capturées et on leur plante un tube pour siphonner leur sang (voir la photo ci-dessus). Ensuite, le sang recueilli est centrifugé pour concentrer les amébocytes. En ajoutant de l’eau aux amébocytes emballés, ils se désagrègent et libèrent les protéines de coagulation (le lysat) qui réagissent avec les endotoxines.
Cette façon de fabriquer le LAL est présentée comme une méthode non létale pour obtenir le sang du crabe. Mais elle ne l’est pas. Car tous les crabes ne survivent pas !
Selon la Commission des pêches marines de l’État de l’Atlantique, dans son rapport 2019 d’évaluation de référence du stock de crabe du fer et d’examen par les pairs, 600 000 crabes du fer sont capturés et saignés pour répondre à la demande annuelle de LAL.
Sur ces 600 000 crabes, environ 420 à 540 000 (70 à 90 %) survivent à la procédure. Ajoutez à cela l’empiètement sur l’habitat, le réchauffement climatique et un autre 500 000 + récoltés et tués chaque année pour servir d’appât pour les pêcheries d’anguilles et de buccins et vous pouvez voir pourquoi les populations de limules s’effondrent.
Non seulement cela, mais les crabes sont récoltés en mai et juin quand ils viennent à terre en masse pour s’accoupler, pondre leurs œufs et espérer maintenir leur survie.
Ce n’est pas une situation durable !
Y a-t-il de meilleures façons de faire du LAL ?
“La limule américaine a survécu aux dinosaures et a survécu à quatre extinctions massives précédentes, mais elle est maintenant menacée par l’industrie pharmaceutique, les communautés de pêcheurs, la perte d’habitat, le changement climatique et, plus récemment, les marées étouffantes d’algues rouges au large de la côte est des États-Unis.”de Jonathan Watts dans The Guardian
Il y a deux efforts principaux qui sont présentés comme des moyens d’atténuer cette situation malheureuse.
Une approche essayée par l’industrie pharmaceutique est l’aquaculture de limules.
Au départ, les tentatives de culture de limules n’étaient pas très réussies. Il semblait qu’après 3-4 mois de culture, les concentrations en protéines de l’hémolymphe chutaient à des niveaux entraînant la mortalité. On pensait que ces décès étaient liés à des carences nutritionnelles.
Le Dr Anthony Dellinger est professeur au département de neuroscience de l’Université de Caroline du Nord à Greensboro et scientifique chez Kepley Biosystems Incorporated, Greensboro, NC.
Dellinger et KBI ont travaillé dur pour développer un nouveau système d’aquaculture amélioré. Ils partent du principe que “la collecte contrôlée de LAL à partir de limules surveillées et bien entretenues en aquaculture pourrait augmenter les quantités d’approvisionnement en LAL, assurer la viabilité de l’espèce et permettre de nouvelles innovations cliniques”
Si elle réussit, la production de plus grands volumes de LAL de manière fiable, durable et économique profiterait à la fois à la nature et à l’industrie.
Dellinger et ses collègues ont décrit en détail le fonctionnement de leur système d’aquaculture dans un article publié dans Frontiers of Marine Science en avril dernier.
Regardons les points saillants et les résultats de cette étude.
D’abord, ils ont optimisé un système d’aquaculture intérieure à recirculation qui maintient les limules de façon fiable. Leur objectif était de faciliter la récolte répétitive des LAL tout en maintenant le bien-être des animaux.
L’étape suivante consistait à réaliser une méthode de récolte répétitive à faible impact. Pour ce faire, ils ont implanté chirurgicalement un cathéter dans la limule. Tous leurs tests ont montré que les limules toléraient assez bien ces cathéters.
Voici un résumé rapide de leurs résultats.
Ils ont récolté et maintenu 24 crabes pendant un an avec 100% de survie. Les limules ont été vérifiées pour l’activité LAL, la libération d’œufs et de sperme et d’autres signes qui pourraient indiquer une santé altérée. Aucun de ces signes n’a été observé.
Les crabes ont été saignés par les cathéters environ trois fois par mois, ce qui équivaut potentiellement à environ 36 saignements par crabe sur la période de 12 mois. Aucun problème provenant des cathéters implantés n’a été rencontré au cours de cette période.
Lorsqu’ils ont calculé les coûts encourus, en dehors de l’aménagement initial du système d’aquaculture, l’entretien des crabes revenait à environ 0,76 $ par livre, un montant très abordable !
La question la plus importante à laquelle il fallait répondre était :
Comment le LAL des limules entretenus en interne se compare-t-il à celui obtenu à partir de crabes fraîchement récoltés ?
Comme le montre la figure 6 de leur article, il n’y avait pas de différence significative dans l’activité de coagulation de l’endotoxine du LAL entre les crabes aquacoles et sauvages. Et il n’y avait pas non plus de réelle différence dans l’activité des saignées prélevées aux jours 1, 16 et 23.
Ces résultats les ont amenés à conclure,
“…l’aquaculture pourrait correspondre aux besoins de l’industrie pendant plusieurs années avec l’équivalent de 5 à 10% de la capture annuelle d’une année, laissant près de 600 000 CSH dans la nature chaque année par la suite. En fait, ces résultats suggèrent que ∼60 000 CSH d’aquaculture pourraient être durablement saignées 12 à 24 fois par an et dépasser la demande actuelle de LAL biomédicale.”
La deuxième approche élimine complètement le besoin de crabes.
Jeak Ling Ding, ainsi que son mari et partenaire de recherche Bow Ho, à Singapour, avaient un objectif – éliminer complètement le besoin de limules.
Elle étudiait le Carcinoscorpius rotundicauda, une espèce asiatique beaucoup plus petite que les limules de l’Atlantique, et on ne pouvait pas les saigner beaucoup sans qu’ils meurent.
Les recherches de Ding sur le LAL ont permis de découvrir qu’une molécule appelée facteur C était responsable de son action coagulante. Ding a isolé le gène du facteur C et a utilisé un virus pour l’insérer dans les cellules intestinales des insectes. Cela a essentiellement transformé les insectes en petites usines qui produisaient le facteur C.
Les insectes modifiés produisent des quantités suffisantes de facteur C, qui pourrait alors être vendu comme facteur C recombinant* (rFC) sur le marché comme un substitut viable au LAL.
* Note: The word recombinant is a term used in molecular genetics to indicate a gene that has been isolated (cloned) and inserted into another organism's DNA so that organism makes the protein that gene specifies. Using a virus is one of many ways to accomplish this.
Alors maintenant, au lieu de récolter ou d’aquaculter des limules et de les saigner, ils pourraient cultiver de grandes quantités d’insectes et isoler le rFC.
Les sociétés pharmaceutiques qui ont utilisé le rFC ont confirmé qu’il fonctionne aussi bien que le LAL et que les coûts de production sont comparables.
“Nous étions juste si enthousiastes en tant que chercheurs, si heureux que cela fonctionne”, a déclaré Ding. “Et nous pensions que le facteur C recombinant serait adopté dans le monde entier, et que la limule serait sauvée.”
Malheureusement, le rFC a rencontré les mêmes obstacles à son adoption que le LAL lors de son introduction. Bien que le rFC soit sur le marché depuis 2003, il a mis du temps à s’imposer. Mais petit à petit, il surmonte les obstacles à son approbation par la FDA. À l’origine, un seul fabricant le produisait – l’entreprise chimique basée en Suisse, le groupe Lonza.
En 2013, Hyglos GmbH est devenue la deuxième entreprise à fabriquer du rFC. Kevin Williams, un scientifique principal chez Hyglos, dit qu’il considère que l’adoption et l’approbation du rFC sont attendues depuis longtemps. Hyglos GmbH a obtenu l’approbation de son utilisation par plusieurs organismes de réglementation européens.
Aujourd’hui, les experts pensent qu’à terme, le rFC deviendra la méthode dominante de détection des endotoxines, laissant les limules complètement décrochées de la production industrielle.
Voilà quelque chose dont les limules peuvent s’accommoder !
Note: In these times of COVID-19, I wouldn't be surprised to see the obstacles removed even faster. Taking and applying research knowledge to improve patient wellbeing is happening faster than ever before. And in cases like this, that's a really good thing!
Ce qui nous amène à la dernière question que je veux examiner :
Pourquoi nous soucions-nous de la survie des limules, de toute façon ?
Ne sont-ils pas juste d’anciennes reliques dont notre écosystème moderne pourrait facilement se passer ? Beaucoup d’autres espèces se sont éteintes et la planète semble plutôt bien se porter.
C’est une question valable, alors examinons-la un peu plus en profondeur.
La réponse réflexe est “bien sûr que nous voulons les sauver !”. Nous avons suffisamment de créatures sur cette planète déjà menacées ou qui se sont déjà éteintes. Nous ne pouvons tout simplement pas nous permettre d’en perdre d’autres.
Comme je l’ai dit, c’est plus une réaction instinctive, pas une réponse sur laquelle on peut s’accrocher. Pour une meilleure réponse, nous devons examiner comment les limules s’inscrivent dans le tableau d’ensemble.
Débutons par ce qu’ils mangent et ce qui les mange.
La limule adulte se nourrit de petits mollusques comme la moule bleue et la mactre d’Amérique, et de vers annélides.
En 2017, les moules bleues ne sont pas en grave danger selon ce rapport du Safina Center de l’Université Stony Brook. Il en va de même pour les annélides et les mactres de surf.
Les juvéniles se nourrissent de petites particules de matière algale et animale. Au fur et à mesure que l’animal grandit, il en va de même pour les proies qu’il consomme.
Dans l’ensemble, il semble que les limules n’aient pas d’effets néfastes sur leurs espèces proies.
Ok, c’est un côté de la médaille. Qu’en est-il de l’autre ? Qu’est-ce qui mange les limules ?
Les œufs de limule sont une source de nourriture pour de nombreux organismes.
Ce sont notamment les oiseaux de rivage, certains poissons – bar rayé, killifish rayé, silversides, flets – ainsi que les tortues de mer, les crabes et les buccins. Ils constituent une source de nourriture essentielle pour 11 espèces d’oiseaux de rivage migrateurs. La perte de ces œufs dévasterait ces populations d’oiseaux.
Les tortues de mer caouannes et les oiseaux de rivage comme le bécasseau maubèche dépendent des limules.
Des milliers de ces tortues migrent vers la baie de Chesapeake et du Delaware en été pour se nourrir de ces crabes. On pense maintenant que les caouannes souffrent d’un manque de limules dans la baie de Chesapeake.
Quelques anecdotes rapportent que des limules se retrouvent dans le ventre des alligators et des requins.
Les jeunes limules pourraient aussi être un aliment clé dans le réseau alimentaire côtier. Tout au long de l’été et de l’automne, les larves et les premiers stades de vie des limules pullulent dans les bas-fonds. Ces bouchées sont sans aucun doute englouties par les poissons et les oiseaux de rivage également.
Et il semble qu’il y ait beaucoup d’autres animaux qui les trouvent assez appétissants et qui auraient du mal à trouver des substituts faciles.
Pour une créature qui existe depuis 450 millions d’années, notre compréhension est loin d’être complète quant au rôle que joue le Limulus polyphemus dans l’écosystème côtier.
Dans l’état actuel de nos connaissances sur l’écologie de la limule, nous ne pouvons pas tirer de conclusions définitives sur le caractère essentiel de leur rôle. Ce que nous pouvons dire, c’est qu’ils occupent définitivement une niche qui justifie une étude plus sérieuse.
Malgré cela, je me range du côté de la nécessité de les conserver ! C’est mon attitude “mieux vaut prévenir que guérir”. Nous en savons tout simplement trop peu pour laisser une espèce comme Limulus polyphemus nous glisser entre les doigts et disparaître si nous pouvons l’empêcher.
Alors, y a-t-il quelque chose que vous puissiez faire ?
S’il vous arrive de vivre près d’un endroit où les limules viennent pondre, il est facile de se lancer et d’aider. Il existe des programmes de retournement des crabes et des enquêtes sur les crabes reproducteurs qui reposent sur des bénévoles.
Et enfin, pensez à la limule lorsque vous allez chez le médecin. Tout ce qui est injecté ou implanté dans notre corps est toujours testé pour la contamination par des bactéries gram-négatives avec du LAL fait à partir de sang de crabe des chevaux.
Au revoir
Rich
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Sources d’information utilisées pour cet article :
- Le crabe en fer à cheval
- L’aquaculture du crabe en fer à cheval comme source durable de test d’endotoxine
- Le rôle du crabe en fer à cheval dans l’industrie biomédicale et les tendances récentes ayant un impact sur la durabilité de l’espèce
- Les derniers jours de la récolte de sang bleu.Blood Harvest
- Les secrets sous-marins des limules
- Ce crabe pourrait vous sauver la vie – si les humains ne l’éliminent pas d’abord
- Le NJ a mis fin à sa récolte de limules. Les autres États devraient-ils faire de même ?
- Le site sur la limule créé par Kayla Westerlund
- La limule de l’Atlantique
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