dans les années 1960, deux étapes importantes ont été franchies dans la physiologie de l’absorption intestinale des sucres. La première était l’hypothèse du cotransport Na+-glucose de Crane et ses collègues (1), qui expliquait le transport actif du sucre, et la seconde était la découverte de la malabsorption du glucose et du galactose (MGG) chez les patients (5, 6). L’hypothèse du cotransport a été testée de manière exhaustive, confirmée et étendue pour inclure le “transport actif” d’une grande variété de substrats dans les cellules, allant de l’accumulation de lactose dans Escherichia coli à l’accumulation d’iodure dans la glande thyroïde. Essentiellement, les cotransporteurs sont des machines moléculaires qui utilisent l’énergie stockée sous forme de gradients de potentiel électrochimique ionique à travers les membranes cellulaires, Na+ ou H+, pour entraîner l’accumulation de solutés spécifiques et d’eau dans les cellules (22). Le cotransporteur intestinal Na+-glucose (SGLT1) utilise le Na+ et les gradients électriques à travers la membrane pour conduire le sucre et l’eau dans les entérocytes contre leurs gradients de concentration (9, 13, 23). Le glucose et le galactose sont tous deux pris en charge par le SGLT1, tandis que le fructose est transporté à travers la bordure en brosse par son propre transporteur privé, le transporteur de fructose facilité (GLUT5). Le glucose, le galactose et le fructose terminent leur voyage à travers la cellule dans le sang par un autre transporteur de sucre facilité (GLUT2) dans la membrane basolatérale (Fig.1).

L’AGM est caractérisée par l’apparition néonatale d’une diarrhée sévère aqueuse et acide, qui est fatale en quelques semaines à moins que le lactose (glucose et galactose) ne soit supprimé du régime alimentaire (2). La diarrhée s’arrête avec le jeûne ou le retrait des sucres incriminés du régime alimentaire, mais reprend rapidement avec l’alimentation orale de régimes contenant du lactose, du glucose ou du galactose. L’absorption du fructose n’est pas affectée. Compte tenu des symptômes de la maladie et de ce que l’on savait à l’époque sur l’absorption intestinale des sucres, on a prédit que l’AGM était due à un défaut du cotransporteur Na+-glucose de la bordure en brosse. Cette hypothèse a été renforcée par les expériences autoradiographiques exquises d’absorption du galactose et de fixation de la phlorizine réalisées sur des biopsies muqueuses du premier patient américain atteint de MGF (17, 18). Ces expériences ont montré que la réduction du transport du galactose était associée à une diminution de 90 % de la liaison de la phlorizine à la bordure en brosse. La phlorizine est un inhibiteur compétitif spécifique, non transporté, du SGLT1.

Le test diagnostique le plus fiable pour le GGM est le test respiratoire H2 (Fig.2). L’administration orale de glucose ou de galactose (2 g/kg) entraîne une élévation de l’H2 dans l’haleine largement supérieure à 20 parties/million chez les patients atteints de GGM, mais aucune augmentation de ce type chez les témoins ou les patients nourris au fructose. Les enfants atteints de GGM se développent “normalement” avec des formules de remplacement du fructose, mais les symptômes réapparaissent même à l’âge adulte avec seulement une cuillère à café de glucose (6 g), et le test respiratoire H2 reste positif. Cette maladie est assez rare. Nous avons connaissance d’environ 200 patients dans le monde, et une grande proportion des cas sont issus de relations consanguines.

La physiologie et la physiopathologie de l’absorption intestinale des sucres ont progressé en 1987 grâce à notre clonage du cotransporteur Na+-glucose de lapin par une nouvelle stratégie que nous avons appelée “clonage d’expression”. Ce succès a été rapidement suivi par le clonage par Turk et Hediger (4) du cotransporteur Na+-glucose humain et l’identification par Turk et al. (20) de la première mutation dans un transporteur à causer une maladie génétique, le GGM. Nous avons obtenu des biopsies intestinales de deux sœurs diagnostiquées avec GGM et des échantillons de sang des parents qui sont cousins. Turk et al. (20) ont identifié une mutation homozygote, faux-sens (Asp28Asn) dans l’ADNc du SGLT1 de chaque sœur, ont découvert que chaque parent était porteur de cette mutation, et ont démontré que cette mutation abolissait complètement le cotransport Na+-glucose en utilisant un test d’expression ovocytaire. Dans la même famille, un dépistage prénatal a ensuite été effectué sur deux fœtus et l’un (le frère ou la sœur du proband) s’est avéré porteur de la mutation Asp28Asn et l’autre (un cousin) s’est révélé normal. Les deux enfants se sont épanouis sans restriction alimentaire et sont restés asymptomatiques pendant au moins deux ans (11).

Les progrès ultérieurs ont été initialement entravés par la difficulté d’obtenir des échantillons de biopsie de la muqueuse d’enfants atteints de GGM jusqu’à ce que Turk et al. (21) réussissent à cartographier l’ensemble du gène humain SGLT1. Ce gène est de grande taille, avec 15 exons répartis sur 72 kb d’ADN. Une fois que les exons et leurs régions flanquantes ont été séquencés, un test de polymorphisme conformationnel simple brin a été mis au point pour dépister les mutations chez les patients en utilisant l’ADN génomique d’un petit échantillon de sang. Ce développement impliquait l’amplification par PCR de chacun des 15 exons et de leurs jonctions intron-exon et l’électrophorèse sur gel des produits PCR dénaturés pour identifier les exons porteurs de mutations. Les exons anormaux ont ensuite été séquencés. Pour déterminer si les mutations étaient responsables du défaut de transport des sucres, les mutants ont été exprimés dans des oocytes de Xenopus laevis pour des tests de captation de Na+-glucose. Martı́n (Réf. 10, 12, et observations non publiées) a été en grande partie responsable de cette phase du projet. Les mutations qui expliquent la maladie ont été identifiées chez 33 des 34 patients GGM examinés. Les patients de 17 lignées portaient des mutations homozygotes et, dans 10 autres lignées, les patients présentaient des mutations hétérozygotes composées. Ces mutations comprenaient 22 mutations faux-sens (voir figure 3) et 4 mutations d’épissage et 3 mutations non-sens qui entraînent la production d’une protéine SGLT1 sévèrement tronquée. L’échec de la détection des mutations chez le 34e patient peut être dû au fait que la mutation se trouvait dans la région promotrice du gène et que l’ADN de cette zone n’a pas été inclus dans la procédure de dépistage.

En tant que physiologiste du transport, je me suis intéressé aux mutations missensives de GGM en raison de leur potentiel dans l’identification des résidus dans la protéine critique pour le transport. Nous avons donc entrepris de déterminer comment les mutations faux-sens provoquent réellement le défaut de transport du Na+-sucre. Dans cette approche, réalisée en grande partie par Lostao (voir Réf. 10 et 12), les protéines mutantes ont été exprimées dans des ovocytes de X. laevis, puis des méthodes biophysiques et biochimiques ont été utilisées pour déterminer le niveau de la protéine dans la cellule et dans la membrane plasmique. Dans les cas où le transporteur a été inséré dans la membrane plasmique, nous avons (7) examiné les réactions partielles du cycle de transport. Nous avons été initialement déçus de constater que pour les 21 premiers mutants faux-sens étudiés, le défaut principal était dû à un mauvais trafic des transporteurs dans la cellule. Sur la base de Western blots, tous les mutants étaient synthétisés à des niveaux similaires ou supérieurs à ceux du SGLT de type sauvage. Cependant, les mesures de charge (7) et la microscopie électronique à rupture par congélation (24) de la membrane plasmique de l’ovocyte ont démontré qu’il y avait une réduction importante du nombre de cotransporteurs dans la membrane plasmique (10, 12). D’après le degré de glycosylation centrale et complexe des mutants, le défaut de trafic du SGLT1 vers la membrane plasmique s’est produit entre le réticulum endoplasmique et le Golgi ou entre le Golgi et la membrane plasmique. Le mauvais repliement des protéines mutantes peut être la cause principale du défaut de transport (19). Dans un seul cas, Gln457Arg, la protéine mutante se trouvait dans la membrane plasmique de l’ovocyte à des niveaux proches de la normale.

Quelle est la pertinence de ces expériences sur les ovocytes pour les intestins des patients GGM ? Pour répondre à cette question, nous avons examiné (données non publiées) la distribution de la protéine SGLT1 par immunocytochimie dans les biopsies muqueuses de trois patients présentant des mutations homozygotes. Dans les trois cas, la distribution des protéines mutantes dans l’ovocyte était identique à la distribution de la protéine SGLT1 dans les entérocytes du patient : dans deux cas, la protéine était dans le cytoplasme, et dans un cas, la protéine était dans la bordure en brosse. Il y a également une concordance entre nos résultats sur les ovocytes et ceux obtenus par des études autoradiographiques de biopsies du premier patient américain GGM (18). Stirling et ses collaborateurs (18) ont constaté que la liaison de la phlorizine à la bordure en brosse du patient était réduite de 90 %, et nous n’avons trouvé aucune protéine SGLT1 mutante (Cys355Ser et Leu147Arg) dans la membrane plasmique des ovocytes (10). Ces études suggèrent que, au moins avec ces quatre mutants GGM, l’ovocyte récapitule le comportement de la protéine mutante dans l’entérocyte.

Une question majeure restante est de savoir comment les mutations faux-sens distribuées dans toute la protéine (Fig. 3) perturbent le trafic du transporteur vers la membrane plasmique. Les réponses à cette question sont importantes pour comprendre la biosynthèse des protéines de la membrane plasmique et pour concevoir des thérapies améliorées pour les enfants atteints de GGM.

La mutation GGM dans une famille, Gln457Arg, a fourni des informations précieuses sur le mécanisme de transport du sucre. Lostao a étudié (en préparation) le comportement du Q457R SGLT1 exprimé dans des ovocytes et dans la muqueuse intestinale du patient et a constaté que la protéine est traduite, glycosylée et insérée dans la membrane plasmique, mais qu’elle est incapable de transporter le sucre. En l’absence de sucre, la protéine mutante transporte le Na+ par la voie de la fuite de Na+ ou de l’uniport de Na+, ce qui est bloqué par la phlorizine. Le glucose est également un inhibiteur car il bloque également cette voie de transport du Na+, ce qui indique que le glucose se lie à Q457R SGLT1 mais qu’il n’est pas transporté, c’est-à-dire que la mutation produit un défaut de translocation du sucre. Panayotova-Heiermann et ses collègues (15) ont indépendamment démontré que le “pore” de sucre à travers SGLT1 est formé par le domaine COOH-terminal de SGLT1 portant le résidu Q457.

Pour exploiter ces observations, nous avons examiné le rôle de Q457 dans la translocation du sucre. Dans cette étude, il a été constaté que le mutant de la cystéine Q457C conservait une activité complète de transport du Na+-glucose, à l’exception d’une augmentation de la constante apparente de Michaelis-Menten du glucose (Km) de 0,4 à 6 mM, et il a été constaté que la mutagenèse chimique de Q457C avec des réactifs alkylants chargés ou neutres (méthanethiosulfonates, MTS) bloquait complètement le transport du sucre. Cependant, étant donné que la protéine Q457C alkylée lie le glucose avec une constante de dissociation très similaire au Km apparent pour le transport du sucre par le SGLT1 Q457C, ce résidu ne doit pas faire partie du site de liaison du sucre. L’inhibition du transport du sucre par Q457C par le MTS ne s’est produite que lorsque le cotransporteur était dans la conformation Na+ tournée vers l’extérieur, C2 (Fig.4). Le réactif n’était pas efficace en l’absence de Na+, en présence de Na+ et de glucose (ou de phlorizine), ou en présence de Na+ à des potentiels membranaires dépolarisés. Les expériences de saut de tension avec Q457C marqué à la rhodamine ont également montré que l’évolution dans le temps et le niveau de fluorescence suivaient de près la transition du cotransporteur entre les conformations C2 et C6 (Fig. 4). Nous interprétons ces résultats comme signifiant que le cotransporteur peut exister dans au moins trois conformations différentes (C6, C2 et C3) et que le couplage entre le transport du Na+ et du sucre se produit par des changements conformationnels de la protéine induits par le ligand et le voltage.

Des études préliminaires avec deux autres mutations faux-sens GGM dans le domaine COOH-terminal de SGLT1, A468V et R499H (Fig. 3), montrent que le remplacement des résidus par des cystéines restaure le trafic de la protéine vers la membrane plasmique de l’ovocyte. Les deux protéines sont fonctionnelles, et le transport des sucres est bloqué par les réactifs MTS. Comme dans le cas de Q457C, ces résidus ne sont accessibles aux réactifs MTS que lorsque les protéines sont dans la conformation C2. Ces résultats soutiennent mon opinion selon laquelle les hélices transmembranaires 10-13 (Fig. 3) forment le pore de sucre. D’autres travaux sont nécessaires pour identifier le pore de Na+.

En résumé, les études de biologie moléculaire sur le SGLT1 ont conduit au clonage de l’ADNc du SGLT1 humain et à la cartographie du gène, qui ont fourni de nouveaux outils puissants pour examiner la physiologie du cotransport Na+-glucose et pour étudier le GGM. Il a été confirmé que l’AGM est due à des mutations du gène du SGLT1, et la plupart de ces mutations entraînent soit une protéine SGLT1 tronquée, soit un mauvais trafic du transporteur dans la cellule. Comme on peut s’y attendre pour une maladie autosomique récessive, une mutation privée produit la maladie dans chaque parenté et la fréquence de la maladie augmente dans les cultures où la fréquence des mariages consanguins est élevée. Bien que l’AGM soit rare, il est possible que le plus grand nombre d’individus porteurs de mutations légères du SGLT1, ou de mutations sévères sur un seul allèle, présentent une altération de l’absorption du glucose et du galactose. Environ 10% de la population normale, des étudiants en médecine, ont donné des tests respiratoires positifs au glucose H2 (14). Cette interface entre la physiologie et la maladie a non seulement augmenté la compréhension de la physiopathologie de l’absorption du sucre mais a fourni de nouvelles approches pour étudier les mécanismes moléculaires du couplage entre le Na+ et le transport du sucre à travers les membranes plasmiques.

FOOTNOTES

• * Premier d’une série d’articles invités sur les troubles génétiques du transport membranaire.