ImmunohistochimieModifier

L’immunohistochimie ou coloration IHC des coupes de tissus (ou immunocytochimie, qui est la coloration des cellules), est peut-être la technique d’immunomarquage la plus couramment appliquée. Si les premiers cas de coloration IHC utilisaient des colorants fluorescents (voir immunofluorescence), d’autres méthodes non fluorescentes utilisant des enzymes telles que la peroxydase (voir coloration par immunoperoxydase) et la phosphatase alcaline sont maintenant utilisées. Ces enzymes sont capables de catalyser des réactions qui donnent un produit coloré facilement détectable par microscopie optique. Alternativement, des éléments radioactifs peuvent être utilisés comme marqueurs, et l’immunoréaction peut être visualisée par autoradiographie.

La préparation ou la fixation des tissus est essentielle pour la préservation de la morphologie cellulaire et de l’architecture tissulaire. Une fixation inappropriée ou prolongée peut diminuer de manière significative la capacité de liaison des anticorps. De nombreux antigènes peuvent être mis en évidence avec succès dans des coupes de tissus fixés au formol et inclus en paraffine. Cependant, certains antigènes ne survivront pas à une fixation à l’aldéhyde, même modérée. Dans ces conditions, les tissus doivent être rapidement congelés dans l’azote liquide et coupés avec un cryostat. Les inconvénients des coupes congelées sont notamment une morphologie médiocre, une mauvaise résolution à des grossissements plus élevés, la difficulté de couper sur des coupes en paraffine et la nécessité d’un stockage congelé. En revanche, les coupes au vibratome ne nécessitent pas que le tissu soit traité par des solvants organiques ou une chaleur élevée, qui peuvent détruire l’antigénicité, ou perturbé par la congélation-décongélation. L’inconvénient des coupes au vibratome est que le processus de sectionnement est lent et difficile avec des tissus mous et mal fixés, et que des marques de broutage ou des lignes de vibratome sont souvent apparentes dans les coupes.

La détection de nombreux antigènes peut être considérablement améliorée par des méthodes de récupération de l’antigène qui agissent en brisant certaines des liaisons transversales des protéines formées par la fixation pour découvrir les sites antigéniques cachés. Cela peut être accompli en chauffant pendant des durées variables (récupération des épitopes induite par la chaleur ou HIER) ou en utilisant une digestion enzymatique (récupération des épitopes induite par la protéolyse ou PIER).

L’une des principales difficultés de la coloration IHC est de surmonter le fond spécifique ou non spécifique. L’optimisation des méthodes et des temps de fixation, le prétraitement avec des agents bloquants, l’incubation des anticorps à haute teneur en sel et l’optimisation des tampons de lavage post-anticorps et des temps de lavage sont tous importants pour obtenir une immunocoloration de haute qualité. En outre, la présence de contrôles positifs et négatifs pour la coloration sont essentiels pour déterminer la spécificité.

Cytométrie en fluxModifier

Un cytomètre en flux peut être utilisé pour l’analyse directe de cellules exprimant une ou plusieurs protéines spécifiques. Les cellules sont immunocolorées en solution à l’aide de méthodes similaires à celles utilisées pour l’immunofluorescence, puis analysées par cytométrie en flux.

La cytométrie en flux présente plusieurs avantages par rapport à l’IHC, notamment : la possibilité de définir des populations cellulaires distinctes par leur taille et leur granularité ; la capacité d’éliminer les cellules mortes ; une meilleure sensibilité ; et une analyse multicolore pour mesurer plusieurs antigènes simultanément. Cependant, la cytométrie en flux peut être moins efficace pour détecter des populations cellulaires extrêmement rares, et il y a une perte des relations architecturales en l’absence d’une coupe de tissu. La cytométrie en flux a également un coût d’investissement élevé associé à l’achat d’un cytomètre en flux.

Blotage occidentalModifier

Le Western blotting permet la détection de protéines spécifiques à partir d’extraits réalisés à partir de cellules ou de tissus, avant ou après toute étape de purification. Les protéines sont généralement séparées par leur taille à l’aide d’une électrophorèse sur gel avant d’être transférées sur une membrane synthétique par des méthodes de blotting sec, semi sec ou humide. La membrane peut ensuite être sondée à l’aide d’anticorps par des méthodes similaires à l’immunohistochimie, mais sans qu’il soit nécessaire de la fixer. La détection est généralement effectuée en utilisant des anticorps liés à la peroxydase pour catalyser une réaction chimioluminescente.

Le blotting de Western est une méthode de routine de biologie moléculaire qui peut être utilisée pour comparer de manière semi-quantitative les niveaux de protéines entre les extraits. La séparation de taille avant le blotting permet de jauger le poids moléculaire de la protéine par rapport à des marqueurs de poids moléculaire connus.

Edit

Le test immuno-enzymatique ou ELISA est une méthode de diagnostic permettant de déterminer quantitativement ou semi-quantitativement les concentrations de protéines à partir de plasma sanguin, de sérum ou d’extraits de cellules/tissus dans un format de plaque multi-puits (généralement 96 puits par plaque). En gros, les protéines en solution sont adsorbées sur des plaques ELISA. Des anticorps spécifiques de la protéine en question sont utilisés pour sonder la plaque. Le bruit de fond est minimisé en optimisant les méthodes de blocage et de lavage (comme pour l’IHC), et la spécificité est assurée par la présence de contrôles positifs et négatifs. Les méthodes de détection sont généralement colorimétriques ou basées sur la chimiluminescence.

Microscopie immuno-électroniqueModifier

La microscopie électronique ou EM peut être utilisée pour étudier la microarchitecture détaillée des tissus ou des cellules. L’immuno-EM permet de détecter des protéines spécifiques dans des coupes tissulaires ultrafines. Les anticorps marqués avec des particules de métaux lourds (par exemple, de l’or) peuvent être visualisés directement par microscopie électronique à transmission. Bien qu’elle permette de détecter la localisation sub-cellulaire d’une protéine, l’immuno-EM peut être techniquement difficile, coûteuse et nécessiter une optimisation rigoureuse des méthodes de fixation et de traitement des tissus. La biotinylation des protéines in vivo a été proposée pour pallier les problèmes causés par l’incompatibilité fréquente de la coloration des anticorps avec les protocoles de fixation qui préservent mieux la morphologie cellulaire.