Clostridium botulinum – Botulisme (formes cliniques). Tests pour le diagnostic du botulisme. Détection de la toxine chez les patients, dans les denrées alimentaires, les aliments pour animaux, les boues ou les sédiments aquatiques ; oiseaux aquatiques, autres échantillons. Tests recommandés : détection de la toxine, culture de C. botulinum, toxine botulique typée ; diagnostic moléculaire (PCR).

Caractéristiques de Clostridium botulinum et de la ou des toxines botuliques

Clostridium botulinum est un bacille gram positif anaérobie strict, genre Clostridium, famille Clostridiaceae, sporulé, qui produit une toxine neurotoxique. Cette bactérie se trouve généralement dans le sol et dans les eaux douces non traitées et les sédiments (océans, lacs), avec une répartition mondiale. Dans certaines circonstances, cet organisme peut contaminer les aliments et s’y développer pour produire sa ou ses toxines. Le botulisme, une forme grave d’intoxication alimentaire, résulte de l’ingestion d’aliments contenant la toxine. Bien que cette maladie soit rare, son taux de mortalité est élevé. Lorsque le type de toxine a été déterminé parmi les 1036 cas détectés aux États-Unis entre 1899 et 1990, 384 étaient dus à la toxine A, 106 à la toxine B, 105 à la toxine E et 3 à la toxine F. Parfois, il peut y avoir des cas dus à deux toxines, par exemple A et B.

Toutes les formes de botulisme humain ou animal, sont dues à l’absorption de la toxine botulique formée lors de la multiplication de la bactérie Clostridium botulinum. La toxine a une toxicité (neurotoxicité) très élevée, de sorte qu’elle exerce son action à des niveaux extrêmement faibles, est thermolabile, tandis que les spores de la bactérie sont résistantes à la chaleur et survivent dans les aliments chauffés à plus de 100ºC, comme les conserves soumises à un traitement thermique. Par ailleurs, certaines souches de C. botulinum, C. butyricum, C. baratii et C. argentinense peuvent produire des neurotoxines botuliques.

Il existe sept types de toxines (A – G) différenciables par des tests de neutralisation, utiles en clinique et en épidémiologie. Les types A, B, E et F sont les principales causes du botulisme humain, tandis que les types C et D se retrouvent dans les cas de botulisme animal, les plus touchés étant les oiseaux et volailles sauvages, les bovins, les chevaux et certaines espèces de poissons. Les types A et B sont les plus fréquents chez l’homme, et sont principalement liés à la contamination de légumes en conserve préparés à la maison, mais en Europe, ces types ont également été trouvés en relation avec des produits carnés. Le type E (poisson) se trouve dans les environnements aquatiques et est corrélé avec les cas de botulisme E concernant des poissons ou des crustacés contaminés, et est en augmentation. Le type F est exceptionnel. Le type C est subdivisé en C1 (neurotoxine) et C2 (non neurotoxine affecte la perméabilité vasculaire et entérotoxique). Le type G est produit par C. argentiniense (isolé à partir de la terre en Argentine, le sérum de patients décédés, bien qu’il ne soit pas clair implication).

Les toxines sont synthétisées pendant la croissance de la bactérie comme une protéine inactive (150 kDa), qui est libéré de la bactérie au cours de la lyse. Pour activer la toxine formée doit se dégrader en deux chaînes polypeptidiques (50 et 100 kDa).

C. botulinum, peut se différencier en groupes selon leurs caractéristiques de culture, biochimiques et physiologiques. Toutes les cultures de type A et certaines de type B et F sont protéolytiques. Les cultures de toxines de C. botulinum produites par les types C et D ne sont pas protéolytiques, lorsqu’elles sont cultivées dans un milieu avec du blanc d’oeuf coagulé ou de la chair. Tous les types E et certains du type B et F sont non-protéolytiques, mais ont des caractéristiques du métabolisme des glucides qui diffèrent des groupes non-protéolytiques types C et D. Les souches du type G n’ont pas Il a été étudié en détail suffisant pour une caractérisation efficace et satisfaisante.

La température optimale pour la croissance et la production de toxines est d’environ 35ºC pour les souches protéolytiques ; pour les souches non-protéolytiques est de 26-28ºC. Les souches non protéolytiques de type B, E et F peuvent produire des toxines à des températures de réfrigération (3-4ºC). Les toxines des souches non protéolytiques ne présentent pas leur toxicité maximale avant l’activation de la toxine par la trypsine. Les toxines des souches protéolytiques sont généralement produites sous sa forme activée.

Formes cliniques du botulisme

Il existe quatre formes cliniques de botulisme humain :

• Intoxication alimentaire (botulisme d’origine alimentaire), due à l’ingestion d’aliments contaminés par Clostridium botulinum dans lesquels se forme la toxine.

• Botulisme de plaie, produit par l’infection de la plaie par Clostridium botulinum et le développement de la toxine in vivo après la culture de la bactérie dans la plaie.

• Botulisme infantile, produit par la production de toxine dans le tube digestif des jeunes enfants colonisés par Clostridium botulinum (la cause la plus fréquente est due à l’ingestion de miel ou de sirop de maïs contaminés), suivie de l’absorption de la toxine. Ces patients peuvent avoir des anticorps contre la toxine.

• Botulisme intestinal de l’adulte, causé par une colonisation digestive par Clostridium botulinum chez les personnes âgées, suivie d’une absorption de la toxine. Ces patients peuvent avoir des anticorps contre la toxine.

Dans toutes les formes cliniques de botulisme humain, et de même dans le botulisme animal, la toxine pénètre dans le sang à partir du tube digestif lorsqu’elle est ingérée préformée avec un aliment, ou lorsqu’elle est produite par la bactérie qui colonise le tube digestif (jeunes enfants ou adultes), ou dans des cas exceptionnels enfants à partir d’une plaie infectée par la bactérie. Certains aliments sont plus susceptibles que d’autres de contenir de la toxine botulique. Les aliments dont le pH est inférieur à 4,5 sont plus difficilement à l’origine du botulisme car à ce pH, C. botulinum est incapable de se multiplier et de produire de la toxine (c’est le cas des jus de fruits, des aliments marinés au vinaigre…). A l’inverse, les aliments dont le pH est égal ou supérieur à 4,5 peuvent provoquer le botulisme, car dans ceux-ci la multiplication et la production de toxine est possible (c’est le cas de la viande, du poisson, des légumes, des plats préparés, etc.), sur tous ces aliments l’exposition à l’oxygène est nulle, comme pour les aliments en conserve ou sous vide, et ayant un pH supérieur à 4,6. Exemples d’aliments dangereux : jambon cru, fumé, poisson ou légume en conserve (soumis à un traitement thermique insuffisant pour tuer les spores), etc. Les boîtes de conserve contaminées par C. botulinum sont généralement bombées, bien que cela ne se produise pas avec le type E.

La toxine absorbée se fixe de manière irréversible aux jonctions neuromusculaires des motoneurones, empêchant la libération d’acétylcholine et provoquant une paralysie flasque ou une faiblesse musculaire.

Cliniquement, elle se caractérise par une paralysie flasque aiguë, qui commence généralement par une atteinte bilatérale des nerfs crâniens, affectant les muscles du visage, de la tête et du pharynx, puis descend symétriquement pour affecter les muscles du thorax et les membres. La mort, lorsqu’elle survient, est due à une insuffisance respiratoire par paralysie des muscles de la langue et du pharynx qui obstruent les voies aériennes supérieures, ou par paralysie du diaphragme et des muscles intercostaux. Pour cette raison, les patients doivent recevoir de l’antitoxine botulique et des soins intensifs respiratoires nécessaires.

Tests diagnostiques du botulisme

Détection de la toxine botulique dans des échantillons ou des aliments sans culture (voir échantillon recommandé dans la section test “Test proposé par l’IVAMI et échantillons requis”).

Ce test est recommandé chez un patient présentant des signes cliniques de botulisme.

La détection de la toxine botulique peut être effectuée dans un liquide tel que le sérum obtenu à partir du sang. Elle peut également être détectée à partir des restes d’aliments consommés qui ont provoqué un cas ou une épidémie de botulisme. Pour effectuer le test à partir de restes d’aliments, il est nécessaire d’obtenir un extrait filtré de ceux-ci. Dans les cas de botulisme infantile ou de botulisme intestinal, la présence de toxine peut être détectée dans les selles des enfants ou des patients, mais il est préférable d’effectuer une culture préliminaire des selles (voir ci-dessous). La détection de la toxine botulique dans l’un ou l’autre des cas est effectuée par inoculation à des souris qui développent des symptômes paralytiques, suivis de la mort, si on leur inocule la toxine botulique. Pour confirmer que les souris sont mortes de la toxine botulique inoculée, il est nécessaire de réaliser un test de neutralisation, qui confirme la présence de la toxine botulique et identifie le type de toxine botulique présente. Ce test de neutralisation est réalisé face au produit inoculé (sérum de personne ou d’animal, extrait d’aliment ingéré, …) à des antisérums spécifiques de chaque type de toxine.

Avant l’étape du test de neutralisation, il est nécessaire de calculer la dose létale minimale (DLM). Ainsi on calcule la dilution maximale (la plus élevée) qui provoque la mort des animaux infectés, et le volume inoculé a provoqué la mort des animaux contiennent une dose minimale létale (DML).

Pour identifier le type de toxine, une fois connue la “Dose minimale létale”, celle-ci est confrontée à différents antisérums anti-toxine de type botulique. Ces mélanges seront inoculés en volume égal à des souris expérimentales et celles qui survivent, ont été inoculées avec le mélange de la “dose létale minimale” plus un antisérum à un type qui a été capable de neutraliser.

Détection de la toxine dans les échantillons / produits après préculture (voir échantillon recommandé après dans le test proposé par l’IVAMI et échantillons requis).

Lorsque la bactérie Clostridium botulinum, qui produit la toxine, peut être trouvée dans l’échantillon, il est recommandé avant la culture, de rechercher la toxine après avoir cultivé l’échantillon. C’est le cas des fèces d’un patient atteint de botulisme infantile ou de botulisme intestinal, des restes d’un aliment consommé dans lequel avait proliféré la bactérie (par exemple, une conserve), d’un aliment suspecté de contenir la bactérie (par exemple, une conserve bombée), d’un aliment sous contrôle pour exclure la présence de cette bactérie (par exemple, saucisses, jambons, boîtes de conserve), ou d’autres échantillons tels que des boues d’eau douce ou des sédiments marins aquatiques, etc. provenant de zones où une mortalité a été observée chez les oiseaux aquatiques.

Lors de la culture en laboratoire, dans des milieux de culture appropriés, la toxine est produite s’il y a une bactérie et l’obtention d’un filtrat de culture peut être utile pour rechercher sa présence, en inoculant le filtrat à des souris. Si les souris inoculées sont affectées, cela indique la présence probable de Clostridium botulinum dans l’échantillon ou sa croissance en culture. Cependant, les souris peuvent être mortes d’une autre cause, donc nécessaire, avant d’émettre le rapport, doit être vérifié qu’ils sont vraiment morts pour avoir été inoculé avec la toxine botulique.

Pour confirmer la présence de toxine botulique dans la culture des tests de neutralisation en utilisant des antisérums spécifiques pour chaque type de toxine botulique (test de neutralisation) peut être effectuée, ou la détection pour la présence de gènes Clostridium botulinum et son type dans le milieu de culture (détection moléculaire par PCR).

Le test de neutralisation est réalisé face à l’échantillon inoculé (filtrat de culture) à des antisérums spécifiques de chaque type de toxine.

Avant l’étape du test de neutralisation, il est nécessaire de calculer la dose létale minimale (DLM). Ainsi, on calcule la dilution maximale (la plus élevée) qui provoque la mort des animaux inoculés, et le volume inoculé a provoqué la mort des animaux contiennent une dose létale minimale.

Pour identifier le type de toxine, une fois connue la “dose létale minimale”, on réalise la confrontation de la dose létale minimale avec différents types de sérums anti-botuliques. Ces mélanges seront inoculés en volume égal aux souris expérimentales et celles qui survivent, ont été inoculées avec le mélange de la “dose létale minimale” plus un antisérum à un type qui a été capable de neutraliser.

La détection moléculaire par PCR évite le temps nécessaire au calcul de la dose létale minimale (DLM) et au test de neutralisation.

Détection des anticorps anti-toxine botulique (voir échantillon recommandé après dans la section Test proposé par l’IVAMI et échantillons requis)

• Patients traités par la toxine botulique diluée, tels que ceux recevant du botox pour des traitements esthétiques ou médicaux (ex. gr. douleur due à une névralgie faciale du trijumeau), afin de détecter la présence d’anticorps qui empêchent son action.

• Patients ayant une suspicion de botulisme infantile ou de botulisme adulte qui n’a pas pu trouver la bactérie Clostridium botulinum toxin dans les selles ou le sérum.

• Les personnes vaccinées qui souhaitent vérifier l’état de leur protection.

La toxine Clostridium botulinum, à très haute dilution, a été utilisée par administration locale pour traiter les processus spastiques. Ces processus se sont révélés être un remède utile. Ces processus sont généralement spastiques chroniques, ce qui nécessite l’administration permanente de la toxine. Par conséquent, une résistance peut apparaître au cours du traitement en raison de l’immunisation progressive du patient tout au long du traitement, auquel cas l’effet serait limité. Pour détecter cette immunisation il est nécessaire de mesurer de manière précise et sensible l’existence d’anticorps contre la toxine botulique A et/ou B.

La méthode de référence acceptée pour détecter et quantifier les anticorps contre la toxine botulique est le test de neutralisation chez la souris (Mouse Neutralization Assay), dans lequel une dilution de toxine botulique, quantifiée par la Dose Létale 50% pour la souris (DL50), mélangée à diverses dilutions en base 2 ou en base 4 du sérum/plasma, et après incubation chacune sont inoculées par voie intrapéritonéale à des groupes de souris. La plus haute dilution du sérum testé qui réduit la toxicité correspond au titre d’anticorps contre la toxine botulique correspondante. Cette dilution, comparée à une norme internationale permet d’obtenir des résultats en unités internationales (UI/mL) (1 UI est définie comme la quantité d’anticorps qui neutralise 10 000 LD50 de toxines A ou B, ou 1000 LD50 de type E). La quantité de toxine utilisée dans les tests est celle qui est neutralisée par 0,02 ; 0,005 et 0,0125 UI/mL d’antitoxine pour les types A, B et E, respectivement (Hatheway et al. 1984). Les sérums qui protègent le titre de souris de 1 : 4 sont rapportés comme <0,08 UI / mL pour le type A, ou <0,02 UI / mL pour le type B. Le test est laborieux, coûteux et de longue durée d’exécution, de sorte que des alternatives ont été recherchées enmzimoinmunoanálisis méthodes basées (ELISA) en utilisant des microplaques recouvertes de toxine botulique. Cependant, les valeurs obtenues par ELISA ne sont parfois pas totalement corrélées avec le test de neutralisation chez la souris.

Avant l’étape du test de neutralisation, il est nécessaire de calculer la dose létale minimale (DLM) de toxine. Le calcul de la dose létale minimale est effectué par des dilutions de base 10 du filtrat de culture, en diluant la moitié avec du sérum physiologique pour obtenir la même dilution que la toxine mélangée au sérum ou au plasma du patient, et en inoculant chaque mélange de dilution à des souris de laboratoire. On calcule ainsi la dilution maximale (la plus élevée) qui provoque la mort des animaux infectés. Le volume inoculé ayant provoqué la mort des animaux contient une dose létale minimale (DLM).

Une fois connue la dose létale minimale, calculer la dose non létale minimale (dmnm) correspondant à la quantité minimale de toxine en présence d’une quantité constante d’antitoxine, qui ne tue pas les souris inoculées. Cette quantité de toxine est neutralisée par les unités correspondantes d’antitoxine anti-A ou d’antitoxine anti-B. La dose minimale non létale est appelée ainsi parce que c’est la quantité minimale de toxine qui ne provoque pas la mort des souris en présence d’antitoxine .

Tests proposés par l’IVAMI et échantillons requis:

• Détection de la toxine botulique dans les cas humains ou les épidémies de botulisme d’origine alimentaire:

• • Sérum du patient (5 ml au moins) le plus récemment obtenu pour l’inoculation aux souris et le typage de la toxine, si les souris ont été affectées.

• • En cas de botulisme infantile ou de botulisme intestinal, la toxine botulique peut être détectée dans les selles des enfants / patients, mais nous recommandons plutôt de réaliser une culture préliminaire des selles.

• Détection de la toxine et/ou du Clostridium botulinum dans les aliments ingérés, suspectés de provoquer le botulisme, ou les aliments soumis à contrôle

• • Echantillon de l’aliment suspect ou contrôlé (au moins environ 100 grammes recommandés) pour préparer un échantillon destiné à l’inoculation de souris et à la détection de la présence de la toxine préformée dans les aliments, ainsi que pour réaliser une culture afin d’obtenir le filtrat destiné à l’inoculation aux souris et à la détermination de la présence d’une bactérie productrice de toxine dans l’échantillon ; Si vous n’avez que des restes de nourriture, il est recommandé d’envoyer la totalité de la quantité disponible.

• Détection de Clostridium botulinum en cas de botulisme infantile ou de botulisme intestinal

• • Fécès en cas de botulisme infantile ou de botulisme intestinal dû à une colonisation intestinale (10 g), pour la culture et la détection de toxines dans le filtrat de culture par inoculation à des souris.

• Détection de Clostridium botulinum en cas de botulisme de plaie

• • Exsudat de plaie en cas de suspicion de botulisme de plaie, pour culture et détection de toxine dans le filtrat de culture par inoculation à la souris. Si l’échantillon est transporté en aérobiose, Clostridium botulinum peut avoir été inactivé, il serait plus pratique d’effectuer un test moléculaire pour la présence de gènes de Clostridium botulinum et si positif, identifier le type de toxine botulique en détectant les gènes correspondant à chaque type de toxine.

• Détection de Clostridium botulinum dans des échantillons de boues d’eau douce ou de sédiments marins aquatiques, et autres produits non inclus dans les sections précédentes

• • Des échantillons de 100 g environ pour réaliser une culture de croissance de Clostridium botulinum et obtenir un filtrat de culture pour inoculer des souris.

• Détection d’anticorps anti-toxine botulique dans le sérum ou le plasma

• • Sérum ou plasma (environ 10 mL), pour rechercher les anticorps de neutralisation dans le sérum ou le plasma contre différentes toxines disponibles au laboratoire. Ce test est intéressant pour déterminer la présence d’anticorps spécifiques chez les personnes traitées par la toxine botulique, chez les patients suspectés de botulisme infantile, chez les adultes qui n’ont pas pu trouver la bactérie dans les selles, ou chez les personnes vaccinées pour vérifier le statut de protection. Dans le cas de personnes traitées par la toxine botulique Il doit indiquer le type de toxine administré au patient.

Délai de rendu des résultats (TAT)

• Nous ne pouvons pas donner de délais exacts. Si le test ne concerne que la détection de la toxine par inoculation à la souris et que le résultat est négatif, le rapport des résultats sera d’une semaine maximum. Si les tests incluent la culture de l’échantillon, puis la détection de la toxine faite par inoculation d’un filtrat de culture de souris, le délai serait de deux semaines. Si l’un de ces tests inoculation de souris, extrait d’un échantillon ou filtrat de culture, étaient positifs, le test de neutralisation devrait être effectué chez les souris pour corroborer que c’est la toxine botulique et d’identifier son type par des tests de neutralisation, le temps d’achèvement est de 15 jours.

• Tests PCR en temps réel le rapport sont en 3 ou 4 jours.

Formulaire avec les caractéristiques du produit et le(s) test(s) choisi(s)

• Si vous demandez à effectuer des tests avec le produit, vous devez soumettre une lettre dans laquelle les caractéristiques du produit et les tests choisis à effectuer avec l’échantillon envoyé.

Volume de l’échantillon

• Voir dans chaque cas, en fonction du type de tests proposés par l’IVAMI.

Conditions de stockage et d’expédition des échantillons

• Ils sont envoyés dans les conditions dans lesquelles l’échantillon se trouve habituellement, protégé pour le transport. Dans le cas d’échantillons qui peuvent se décomposer parce qu’il est contaminé par des bactéries, ou par son propre organique (denrées périssables, sérums d’origine animale ou humaine, fèces, boues, … …), les échantillons doivent être stockés et expédiés congelés, ou au moins dans les conditions qui assurent le refroidissement pendant le transport (avec le récipient de l’échantillon à l’intérieur d’une boîte -polystyrène expansé- (liège blanc) avec des packs de froid congelés. Remarque : cet organisme en lui-même ne présente pas de risque de contamination par exposition biologique.

Coût des tests

• Détection de la toxine dans les cas humains / épidémies de botulisme d’origine alimentaire

• • Inoculation à des souris avec du sérum du patient ou un extrait d’aliments ingérés ……………………………….. ……………………………………………………………………………………………………………Consulte [email protected]

• • S’il est positif, test de confirmation pour neutralisation et identification du type de toxine …………….. …………………………………………………………………………………………………………..Consulte [email protected] .

• Détection de la toxine et/ou du Clostridium botulinum dans les aliments ingérés, suspectés de provoquer le botulisme, ou dans les aliments soumis à contrôle

• Détection du Clostridium botulinum en cas de botulisme infantile ou de botulisme intestinal

• • Optionnel : Test d’inoculation à des souris avec du sérum ou un extrait d’aliments ingérés ………………………………….. ……………………………………………………………………………………………………………Consulte [email protected]
  • Recommandé. Test de culture, suivi d’une inoculation de souris avec le filtrat de culture ………………………….. …………………………………………………………………………………………………………..Consulter [email protected]
  • S’il est positif, test de confirmation pour la neutralisation et l’identification du type de toxine …………………….. …………………………………………………………………………………………………………..Consulte [email protected]

• Détection de Clostridium botulinum en cas de botulisme de plaie

• • Test de culture, suivi d’une inoculation de souris avec le filtrat de culture …………………….. Consulter [email protected]
  • S’il est positif, test de confirmation pour la neutralisation et l’identification du type de toxine …………….. ……………………………………………………………………………………………………………Consulter [email protected]
  • Détection de Clostridium botulinum dans des échantillons de boues / eau douce ou sédiments marins, et autres produits non inclus dans les sections précédentes
  • • Test de culture, suivi de l’inoculation de souris avec le filtrat de culture ……………………. Consulter [email protected]
    • S’il est positif, test de confirmation pour la neutralisation et l’identification du type de toxine ………………. …………………………………………………………………………………………………………..Consulter [email protected]
  • Détection de la toxine anti-botulique dans le sérum ou le plasma (se réfère à un type d’anticorps, doit donc indiquer le type de toxine administré à la personne) ………………………………………………… Consult [email protected]