Les tampons d’acétate d’ammonium peuvent causer divers problèmes dans le laboratoire. Deux problèmes courants sont des augmentations surprenantes des contre-pressions HPLC-MS lors du démarrage de l’instrument après un stockage pendant la nuit et des difficultés avec la sensibilité du MS.
L’augmentation de la contre-pression de l’instrument lors de l’utilisation de l’acétate d’ammonium (et du formiate d’ammonium) est un problème courant rencontré sur les forums de chromatographie, en particulier lorsque l’instrument était au repos pendant la nuit ou lors des premiers passages de chaque jour. Les tampons aqueux hautement solubles peuvent causer beaucoup de casse-tête. Ils deviennent problématiques dans la pratique, bloquant les capillaires, les pré-colonnes et les frittes d’extrémité des colonnes analytiques.
Ces problèmes résultent invariablement d’une mauvaise compréhension de la solubilité des tampons dans les milieux aqueux organiques mélangés. On peut y remédier en utilisant les données présentées dans la figure 1.
Figure 1 : Solubilité de cinq tampons en mélange avec l’acétonitrile. (Adapté avec la permission de la Réf. 1)
La figure 1 montre clairement que la solubilité de l’acétate d’ammonium dans les mélanges binaires contenant plus de 90% d’acétonitrile est de plus en plus limitée, et totalement insoluble dans l’acétonitrile à 100%. Alors que l’acétate d’ammonium 20mM est la limite de solubilité à 90% d’acétonitrile, cette limite tombe brusquement à 10mM d’acétate d’ammonium (une concentration tampon populaire utilisée dans les applications LC-MS) pour les mélanges à 95% d’acétonitrile. Le dépassement de ces limites de solubilité donne lieu à un liquide trouble dû à un fin précipité d’acétate d’ammonium dans la solution. Ce précipité peut bloquer les capillaires et les frittes des colonnes, ce qui entraîne une augmentation de la contre-pression du système. Il convient également de noter que les données de la figure 1 sont obtenues en utilisant un tampon de haute qualité – la solubilité diminuera si des réactifs de sel de tampon de moindre qualité (pureté) sont utilisés. Évitez d’essayer de dissoudre l’acétate d’ammonium dans de l’acétonitrile pur, même si de l’eau est ajoutée à la solution. Bien qu’il puisse sembler initialement que le tampon soit soluble, il tombera rapidement de la solution (Figure 2).
Figure 2 : Résidu d’acétate d’ammonium créé lors de la ” dissolution ” de l’acétate d’ammonium dans l’acétonitrile, suivie de l’ajout d’eau pour obtenir le rapport organique / aqueux requis de l’éluant (Photographie gracieuseté du Dr. Paul Ferguson, Astra Zeneca, UK).
Dans un gradient HPLC en phase inversée typique, ce n’est peut-être pas tellement un problème, à moins bien sûr que votre gradient aille jusqu’à >90% d’acétonitrile. Cependant, il y a d’autres considérations, telles que les pourcentages relatifs de solvant organique que le tampon aqueux peut rencontrer lors du mélange en utilisant des systèmes de mélange à basse ou haute pression, lors de l’injection d’échantillons dissous dans des pourcentages élevés d’acétonitrile ou, dans le pire des cas, lorsque les systèmes sont rincés avec 100% d’acétonitrile pour éliminer les contaminants de la colonne ou pour le stockage de nuit.
Il faut en outre tenir compte, lors de l’utilisation d’acétonitrile à 100% pour le stockage de la colonne, du fait que de grands changements de pH peuvent se produire dans un solvant organique à 100% et qu’il faut être attentif au fait que ces changements de pH pourraient amener le pH de stockage de la colonne dans une plage où la dissolution de la matrice de silice pourrait être possible, conduisant à la formation de “fines” à l’intérieur de la colonne, ce qui entraînera finalement des blocages de la colonne (à pH élevé) ou le décapage des ligands de la phase liée (à pH bas).
Acétate d’ammonium comme tampon
Beaucoup ont choisi d’utiliser l’acétate d’ammonium comme tampon, en particulier lors de l’utilisation de la détection MS, en raison de sa volatilité inhérente et de sa faible propension à la contamination de la source API. Cependant, il faut être conscient de cette solubilité limitée et ajuster notre pratique de la CLHP en conséquence. Comprendre si l’utilisation de l’acétate d’ammonium est appropriée pour l’expérience et si un tampon est réellement nécessaire. Les conditions d’utilisation et le choix et la concentration appropriés d’un tampon sont souvent mal compris. L’acétate d’ammonium est le cas d’espèce pour étudier les usages et les mésusages de ce système tampon très apprécié.
Les tampons sont nécessaires pour résister aux petites variations de pH (principalement de l’éluant) et pour s’assurer que la colonne HPLC reste dans un état de charge constant (principalement l’état d’ionisation des espèces silanol résiduelles à la surface du support de silice). Les changements de pH peuvent entraîner des problèmes de stabilité des temps de rétention, de forme des pics et (en cas d’utilisation de la spectrométrie de masse Electrospray) de sensibilité des instruments. Généralement, le plus grand “défi” pour le pH du système provient du mélange du diluant de l’échantillon avec l’éluant dans les composants de connexion entre l’injecteur et la colonne HPLC (ou pré-colonne) et en tête de colonne. Si le diluant de l’échantillon a un pH différent, l’analyte (ou une partie des molécules de l’analyte) peut changer d’état d’ionisation et se chromatographier différemment ou réagir différemment dans l’interface MS. Cependant, il est important de comprendre la chimie de notre méthode analytique pour faire des choix critiques sur le type et la concentration du tampon. Les concentrations d’analyte et la quantité de surface de colonne nécessitant un contrôle du pH sont suffisamment faibles pour ne nécessiter qu’une très faible concentration de tampon pour maintenir des temps de rétention reproductibles, une forme de pic acceptable et une sensibilité de détection.
La figure 3 indique les situations dans lesquelles l’acétate d’ammonium peut être utile à la fois en chromatographie et en spectrométrie de masse.
Figure 3 : Variation du pouvoir tampon pour une solution aqueuse d’acétate d’ammonium (10mM) avec différentes proportions d’acétonitrile (%) (Adapté avec la permission de Ref. 2)
Essentiellement, il existe deux régions tampons lorsque l’acétate d’ammonium 10mM est ajouté à notre solution d’éluant, et que l’on utilise soit de l’ammoniac dilué, soit de l’acide formique pour ajuster le pH. Sans l’ajout de l’acide ou de la base, la solution aura un très faible pouvoir tampon.
En solution aqueuse à 100 %, les valeurs pKa du tampon se situent autour de 4,8 et 9,5. Le tampon est mieux utilisé à environ +/- 1 unité de pH du pKa du tampon, où le pouvoir tampon sera réduit à environ 66%. À 2 unités de pH de distance du pKa du tampon, le pouvoir tampon est réduit à environ 5 %. Pour un tampon d’acétate d’ammonium dans l’eau, le pH de l’éluant utilisé pour la séparation doit être compris entre 3,8 et 5,8 si l’on utilise l’acide formique comme modificateur de pH et entre 8,5 et 10,5 si l’on utilise l’ammoniac pour ajuster le pH de l’éluant. La mise en garde : une fois que l’acétonitrile est ajouté au système, cette plage de travail change et la plage de pH utilisable devient 5,2 à 7,2 ou 7,9 à 9,9 à 60 % d’acétonitrile. Pour les séparations par gradient, le pKa du système tampon change constamment. Le pKa du système à la composition de départ du gradient est utilisé pour estimer l’utilité du tampon pour la séparation.
Ces plages de pH seront-elles suffisantes pour éviter les changements de l’ampleur de l’ionisation de l’analyte ou les changements de protonation de la colonne ? C’est la question clé.
Pour la détection MS, les analytes ionogènes sous forme ionisée donneront lieu à une bonne sensibilité de détection, tout en gérant la rétention en phase inverse par un choix judicieux de la phase stationnaire et du type et de la composition du solvant organique. Si l’analyte est entièrement ionisé dans les plages de pH suggérées ci-dessus (et dans la figure 3), on obtiendra de bonnes performances chromatographiques et de détection. Notez dans la figure 1 que le pouvoir tampon du système diminue avec l’ajout d’acétonitrile, le pouvoir tampon tombant à 30 % de la valeur aqueuse à 60 % d’acétonitrile. Le principe clé de l’utilisation de tampons en LC-MS est d’en utiliser le moins possible pour maintenir la reproductibilité du temps de rétention, une forme de pic acceptable et la sensibilité du détecteur. La concentration du tampon influencera directement la quantité de suppression d’ions rencontrée et, par conséquent, la sensibilité de la méthode sera directement affectée. Pour maintenir un bon pouvoir tampon à des concentrations plus faibles, nous cherchons souvent à travailler à +/- 0,5 unité du pKa du tampon.
Le tableau 1 montre les plages de pH recommandées dans lesquelles les tampons d’acétate d’ammonium seront utiles.
| % MeCN | Gamme maximale de pouvoir tampon (acide acétique / acétate) | Gamme maximale de pouvoir tampon (ammonium / ammoniac) | Pouvoir tampon (% par rapport à une solution 100% Aq) |
| 0 | 4.2 – 5.2 | 9.0 – 10.0 | 100 |
| 20 | 4.7 – 5.7 | 8.7 – 9.7 | 80 |
| 40 | 5.0 – 6,0 | 8,5 – 9,5 | 50 |
| 60 | 5,6 – 6,6 | 8,3 – 9,3 | 30 |
Tableau 1 : Plages de travail de pH recommandées et capacités tampons relatives indicatives pour les systèmes d’éluant acétate d’ammonium (aq) 0,1mM / acétonitrile.
Utiliser les plages tampons du tableau 1 pour sélectionner le pH de l’éluant dans lequel l’analyte doit être ionisé à 100%. Notez que la concentration du tampon utilisée pour dériver ces chiffres est de 0,1mM-un choix populaire pour la concentration du tampon lorsqu’on utilise la détection MS. Pour les analytes basiques, le système tampon acide acétique/acétate est courant, et le pH de l’éluant est généralement bien inférieur au pKa des analytes basiques, ce qui garantit qu’ils sont constamment protonés. Il en va de même pour les analytes acides avec le système ammonium/ammoniac, où les analytes acides doivent tous être entièrement déprotonés. Cela permettra de s’assurer que les temps de rétention sont stables, que les formes de pics sont saines et que la sensibilité du MS est optimisée du point de vue de la chimie de la méthode.
Il existe de grandes lacunes dans les plages de tamponnement efficaces pour les éluants à base d’acétate d’ammonium. C’est-à-dire qu’à une composition d’éluant de 20 % d’acétonitrile (ou une composition de gradient de départ de 20 % d’acétonitrile), il est probable que le pouvoir tampon soit plus faible (des concentrations de tampon plus élevées devront être utilisées) avec un pH d’éluant inférieur à 4,2, entre pH 5,2 et 9,0 ou supérieur à 10,0. Il existe d’autres méthodes où le pH de l’éluant est ajusté en dehors de ces plages recommandées lors de l’utilisation de tampons d’acétate d’ammonium. Envisagez d’utiliser un système tampon différent – le système formate/acide formique est un choix populaire à des valeurs de pH de l’éluant inférieures à 4,2.
Doit-on toujours utiliser un tampon ?
Si le pH de l’éluant est éloigné du pKa de l’analyte, de petites modifications du pH de l’éluant auront un effet négligeable sur le degré d’ionisation de l’analyte. Dans ces circonstances, l’utilisation d’un tampon peut être inutile. Par exemple, les acides acétiques (ainsi que les acides formique, trifluoro et difluoroacétique) ont une importante capacité d'”auto-tamponnage” à faible pH, et fournissent l’analyte basique pKa >2 unités de pH plus élevé et l’analyte acide pKa
Tout ceci suppose que les analytes basiques sont analysés en utilisant un système d’éluant acide et les analytes acides avec un système d’éluant au pH plus basique pour assurer une ionisation complète et une bonne sensibilité de la spectrométrie de masse électrospray. Si vous rencontrez des problèmes de contre-pression de l’instrument, d’instabilité du temps de rétention ou de sensibilité de la détection MS, il peut être utile de se demander si un sel tampon est nécessaire. L’utilisation judicieuse d’acides formique ou acétique ou d’une solution d’ammoniac pourrait bien résoudre tous les problèmes.
Quoi qu’il en soit, prenez le temps de comprendre la chimie de la méthode en ce qui concerne le pKa de votre analyte, le pH de l’éluant requis et le choix du système tampon utilisé pour atteindre et maintenir ce pH dans le système.
Pour ceux qui n’ont pas d’informations sur le pKa de l’analyte, il existe un certain nombre de programmes gratuits qui font un travail raisonnable de prédiction du pKa de l’analyte en fonction de la structure. Largement utilisés dans nos laboratoires sont:
- ChemSketch – https://www.acdlabs.com/resources/freeware/chemsketch/
- MarvinSketch – https://chemaxon.com/products/marvin
Si vous cherchez une compréhension plus approfondie des tampons et de leur utilisation dans le cadre de la HPLC et de la LC-MS, reportez-vous aux articles des références 3-6.
Solubilité des tampons dans les éluants aqueux-organiques pour la chromatographie liquide à phase inversée, Adam P. Schellinger et Peter W. Carr, LCGC North America Volume 22 Numéro 6 Juin 2004
Considérations sur les tampons pour la LC et la LC-MS, Xavier Subirats, Elisabeth Bosch, et Marti Rosés, LCGC North America Volume 27 Numéro 11 Novembre 2009
Tampons de phase mobile, Partie I – L’interprétation du pH dans les phases mobiles partiellement aqueuses, LCGC North America Volume 20 Numéro 11 novembre 2002
Tampons de phase mobile, Partie II – Sélection et capacité des tampons, LCGC North America Volume 20 Numéro 12 décembre 2002
Tampons de phase mobile, Partie III – Sélection et capacité des tampons, LCGC North America Volume 21 Numéro 1 janvier 2003
Tampons de phase mobile en LC : Effet de la méthode de préparation des tampons sur la répétabilité de la rétention, LCGC North America Volume 37, numéro 7, juillet 2019
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