Discussion

Le microbiote humain comprend plus d’un millier d’espèces bactériennes distinctes et joue un rôle majeur dans la santé humaine en favorisant l’approvisionnement en nutriments, en empêchant la colonisation par des agents pathogènes et en façonnant et en maintenant une immunité muqueuse normale. Les bactéries intestinales commensales ont récemment été appréciées comme ayant une véritable relation symbiotique avec l’hôte ; au sein de ce vaste pool de bactéries, les suppléments probiotiques contenant des BL (c’est-à-dire des Lactobacilles et des Bifidobactéries) ont été revendiqués comme ayant une variété d’effets bénéfiques sur la santé humaine, tels que la prévention de la diarrhée et des maladies inflammatoires de l’intestin ou la prophylaxie des infections urogénitales . Cependant, notre connaissance des rôles biochimiques que des espèces et des souches spécifiques jouent dans la santé et les maladies humaines est très limitée. Dans cette étude, nous avons cherché à mieux comprendre les voies de réduction du nitrate dans certaines espèces bactériennes communes colonisant l’intestin humain en utilisant des conditions in vitro compatibles avec les régimes riches en nitrate et les niveaux d’oxygène trouvés sur les surfaces muqueuses du tractus GI. Les principaux résultats de notre enquête indiquent que 1) E.coli, un anaérobie facultatif, convertit le nitrate en nitrite et par la suite en ammoniac qui s’accumule progressivement dans les milieux de culture ; 2) L.plantarum, une bactérie fermentative, cultivée en présence d’hème exogène et de vitamine K2 réalise des processus similaires ; 3) les enzymes d’E.coli génèrent du NO significatif à partir du nitrite uniquement dans des conditions anaérobies ; 4) toutes les cultures LAB examinées génèrent de grandes quantités d’acide lactique provoquant une acidification suffisante des milieux de culture pour conduire la disproportion du nitrite en NO.

La plupart des eucaryotes dérivent leur énergie principalement par la phosphorylation oxydative et doivent respirer de l’O2 pour la formation d’ATP, cependant de nombreuses bactéries entériques, y compris les souches E.coli K12, peuvent utiliser NO3- comme un accepteur d’électrons alternatif lorsque l’O2 est limitant et le nitrate est abondant . E.coli représente le membre modèle des Enterobacteriaceae et bien que cette famille ne constitue qu’une petite fraction du microbiote intestinal, elle est particulièrement importante car certaines souches peuvent provoquer des maladies. Il a également été récemment démontré que le nitrate généré comme sous-produit de l’inflammation de l’hôte peut être utilisé par E.coli pendant la respiration pour conférer un avantage de croissance et surpasser les microbes résidant dans le côlon qui dépendent uniquement de la fermentation . L. plantarum est considéré comme un probiotique sûr et se trouve couramment dans le tractus intestinal des mammifères ainsi que dans la salive humaine, où l’on sait que les nitrates s’accumulent à des niveaux millimolaires en raison du cycle entéro-salivaire du nitrate, qui représente environ 25 % du nitrate circulant global. Cette bactérie présente la voie hétérofermentaire facultative typique de la famille des BL mais, en exclusivité pour cette espèce, des gènes qui codent pour un système nitrate-réductase putatif (narGHJI) ont été récemment identifiés dans le génome de L. plantarum WCFS1, ce qui suggère qu’elle est capable d’utiliser le nitrate comme accepteur d’électrons . En effet, une analyse génétique de L.plantarum publiée récemment a mis en évidence son énorme capacité métabolique diverse et polyvalente.

Dans nos expériences, une activité nitrate réductase significative a été détectée à la fois dans E.coli, et L. plantarum lorsque la tension d’oxygène diminue du niveau atmosphérique vers zéro. Au contraire, B.longum infantis, un anaérobie micro-tolérant du tractus gastro-intestinal des nourrissons, n’a montré aucune capacité à réduire le nitrate même à des concentrations élevées. Les bifidobactéries représentent jusqu’à 90% des bactéries du tractus GI d’un nourrisson et nos résultats sont en accord avec l’observation que le lait maternel humain, qui présente des niveaux particulièrement élevés de nitrites , fournit une source alimentaire de nitrites avant l’établissement d’un microbiote lingual et intestinal capable de réduire les nitrates que l’on trouve normalement dans la flore adulte.

Dans la figure 1, nous avons montré que les cultures d’E.coli contenant 5 mM de NO3- avaient un avantage de croissance compétitif par rapport aux cultures sans ajout de nitrate, puis nous avons déterminé l’effet des gradients d’oxygène et de nitrate sur la production de nitrite et d’ammoniac. Nos résultats indiquent qu’environ 2,5 mM de NO3- à 4% ou moins d’O2 est suffisant pour induire l’expression des enzymes nitrate réductase et qu’après 24 heures une quantité considérable de nitrite s’est accumulée à la fois à l’intérieur des cellules d’E.coli et dans les milieux de culture. Une analyse moléculaire détaillée de la régulation des activités enzymatiques bactériennes dépasse le cadre de cette étude, mais il est bien connu que les souches E.coli K12 expriment trois nitrate réductases contenant du molybdène et que le tungstène peut désactiver ces enzymes en remplaçant l’atome de molybdène au site actif. Nous avons constaté que l’ajout de 300 μM d’oxyde de tungstène à des cultures cultivées comme dans les expériences rapportées à la figure 1 a presque complètement aboli la formation de nitrite (données non présentées). Ainsi, nous pensons que les nitrate réductases dépendantes du molybdène sont responsables de l’étape cruciale de la formation du nitrite. Il est également important de noter que E.coli, ainsi que de nombreuses autres espèces de bactéries, sont sensibles à la toxicité du nitrite en raison de la formation de complexes métal-nitrosyle et qu’elles minimisent cette toxicité par l’induction coordonnée d’un transporteur membranaire de nitrite et d’autres enzymes qui médient la réduction du nitrite. Une description complète des gènes des enzymes nitrate et nitrite réductase de E.coli et de la régulation et de l’expression des opérons peut être trouvée dans d’excellentes publications de Stewart et Cole .

Les voies de réduction des oxydes d’azote dans l’intestin humain

La présence de nitrate et de nitrite dans le tractus GI inférieur dépend de nombreux aspects, y compris les types de bactéries colonisant l’intestin et l’équilibre complexe entre le régime alimentaire et les voies métaboliques des oxydes d’azote. Cependant, la production endogène de nitrate à partir de l’oxydation du NO (principalement par réaction avec l’oxyhémoglobine) est reconnue depuis longtemps comme étant d’un ordre de grandeur supérieur à l’apport alimentaire, comme cela a été démontré à la fin des années 1970 et plus récemment dans des études utilisant des souris déficientes en eNOS. Dans la représentation schématique de la figure 5, nous avons résumé le lien entre la dénitrification respiratoire bactérienne, la réduction des oxydes d’azote en ammoniac, la voie endogène de la L-arginine/NO synthase et la réduction non enzymatique des nitrites en NO. Dans le processus de dénitrification (encadré rouge), le nitrate est réduit en azote gazeux (N2) dans un processus en quatre étapes dans lequel le nitrite, le NO et le protoxyde d’azote sont des accepteurs d’électrons dans des réactions génératrices d’énergie. Récemment, il a été prouvé qu’une voie de dénitrification complète, conduisant à la production de N2, existait dans la plaque dentaire humaine et, bien qu’elle soit encore considérée comme d’importance mineure chez l’homme, nous spéculons qu’elle pourrait avoir un rôle important sous une très faible tension d’oxygène en présence de nitrate et la formation de N2 ne peut être exclue dans l’intestin humain. La dénitrification et la réduction dissimilaire du nitrate en ammoniac (DNRA, encadré bleu) partagent la première étape de réduction du nitrate en nitrite et plusieurs classes de nitrate réductases ont été associées à cette réaction. Dans la DNRA, la deuxième étape est la réduction directe des nitrites en ammoniac à six électrons, qui ne fournit pas d’énergie mais constitue un processus de détoxification assez courant chez les bactéries anaérobies facultatives. Il a été suggéré que la DNRA représente la principale voie du métabolisme des nitrates dans le rumen des mammifères. Cette étude a identifié l’ammoniac comme un produit de la réduction du nitrate dans les bactéries E.coli et Lactobacilli cultivées en présence de mM de nitrate à 4% d’oxygène ou à des niveaux inférieurs.

Expand

La dénitrification respiratoire peut également générer des quantités faibles mais pertinentes de NO comme produit intermédiaire et a été impliquée dans la production bactérienne de NO dans l’intestin . D’autres voies possibles de production de NO sont la conversion acide du nitrite (boîte verte) et l’oxydation de la L-arginine par les enzymes NOS (cercle brun). Dans la figure 4C, nous avons examiné la dépendance protonique de la disproportion non enzymatique du nitrite et montré qu’elle ne devient pertinente que lorsque le pH intracellulaire ou des fluides corporels est inférieur à 5,5. Nos résultats ont également exclu la présence d’enzymes NOS actives dans E.coli et L.plantarum ; cependant, les cellules épithéliales intestinales sont connues pour produire du NO par l’expression des isoformes NOS endothéliales et inductibles. Il est intéressant de noter que la production de NO dans l’intestin pourrait également être déclenchée par les processus enzymatiques des peroxydases, qui sont abondantes sur les cellules de la muqueuse intestinale et il a été démontré qu’elles utilisent le nitrite comme substrat pour produire du NO dans le cadre de leur action antibactérienne.

Nous pensons que toutes ces différentes voies de réduction du nitrate peuvent coexister et se produire simultanément cependant il est probable qu’un seul métabolite prédomine en fonction des conditions physiologiques spécifiques.

Signification physiologique de la formation de NO par la réduction bactérienne du nitrate

Le nitrate et le nitrite alimentaires sont encore imaginés comme des substances toxiques possibles dans de nombreuses études malgré les preuves croissantes que la production de NO à partir de ces ions a des implications bénéfiques importantes pour les fonctions cardiovasculaires, immunitaires et gastro-intestinales . Dans l’intestin, le NO remplit plusieurs fonctions physiologiques telles que la régulation du flux sanguin dans la muqueuse, la mobilité intestinale et l’épaisseur du mucus. La surproduction chronique de NO a également été associée aux maladies inflammatoires de l’intestin et est susceptible d’inhiber la croissance d’une grande variété d’espèces bactériennes. Des études antérieures ont laissé dans l’ombre la façon dont les bactéries intestinales produisaient le NO, cependant Sobko et al. ont montré que contrairement aux rats conventionnels, les niveaux de NO dans l’intestin des rats sans germes sont extrêmement bas et lorsqu’on leur inocule une flore bactérienne normale, la production de NO observée est multipliée par 10.

Dans nos expériences, les concentrations d’oxygène et de protons ont déterminé la voie spécifique de la réduction des nitrates en NO. Les résultats présentés dans la Fig. 4A indiquent que E.coli est capable d’une activité enzymatique de NO dans des conditions anaérobies avec des concentrations de nitrate supérieures à 1 mM, peut-être par l’intermédiaire de la dénitrification ou de l’enzyme nitrite réductase du cytochrome c périplasmique (Nrf) comme proposé par Corker et Poole . Cette génération de NO, cependant, est fortement réduite à 2% d’oxygène et devient indépendante du nitrate. Il est important de noter que nos données sont cohérentes avec le rapport de Sobko et de ses collègues selon lequel E. coli génère des niveaux insignifiants de NO pendant 24 heures d’incubation avec 0,1 mM de nitrate. Les LAB ont produit des quantités considérables de NO en réponse à l’acidification du milieu de culture due à l’accumulation d’acide lactique. Le remplacement du milieu de croissance par du LMRS frais (pH = 6,5) a presque complètement bloqué la capacité des cultures LAB à convertir le nitrite en NO, mais pas chez E.coli. Les mesures du pH de l’intestin se situent entre 5,7 et 7,5, donc la disproportion des nitrites in vivo est probablement un aspect mineur et localisé de la production de NO. Inversement, cette voie est un phénomène bien établi dans l’environnement acide de l’estomac (pH environ 3).

En résumé, nous suggérons que le NO généré par les bactéries intestinales à proximité de la muqueuse intestinale peut soit exercer les effets bénéfiques notés ci-dessus, soit à des niveaux plus élevés, interférer avec ces fonctions. Ainsi, la formation de NO bactérien dans l’intestin peut être considérée comme un modulateur des effets physiologiques et pathologiques.

Implications physiologiques de la formation d’ammoniac bactérien pour la santé

Les bactéries coliques sont connues pour produire de l’ammoniac à partir de la désamination des acides aminés ou via l’uréase, l’hydrolyse de l’urée en dioxyde de carbone et en ammoniac depuis les études séminales de Vince et al. au début des années 1970 . Plus récemment, Cole et ses collègues ont rapporté que le produit principal de la réduction des nitrites dans E.coli est l’ammoniac, avec environ seulement 1% réduit en NO à pH neutre. Les résultats obtenus dans notre étude suggèrent qu’au moins certaines bactéries intestinales communes réduisent principalement les nitrites en ammoniac plutôt qu’en NO. Chez les sujets sains, dans des conditions physiologiques ordinaires, la majeure partie de l’ammoniac produit dans le tractus gastro-intestinal inférieur est ensuite excrétée dans les liquides organiques et métabolisée par les hépatocytes du foie où l’ammoniac et le dioxyde de carbone sont convertis enzymatiquement en phosphate de carbamoyle, qui entre dans la série de réactions appelée “cycle de l’urée” conduisant à la formation d’urée et à son élimination par le rein (voir figure 5). La concentration plasmatique normale d’ammoniac est comprise entre 10 et 35 μM, cependant, lorsque la production d’ammoniac est excessive, l’ammoniac transporté par le sang portal peut contourner le foie, entraînant une hyperammonémie . L’ammoniac dans le sang traverse librement la barrière hémato-encéphalique et des niveaux élevés (>100 μM) ont des effets toxiques sur le système nerveux central conduisant à une encéphalopathie et finalement au coma. Les patients atteints de cirrhose du foie développent très fréquemment une encéphalopathie hépatique (HE) . En l’absence d’insuffisance hépatique, le coma hyperammonémique a été attribué à une septicémie due à des micro-organismes capables de produire de l’uréase, tels que Klebsiella pneumonia . Les approches thérapeutiques classiques de l’EH consistent à réduire les taux d’ammoniac systémique par un traitement antibiotique (pour tuer les bactéries intestinales productrices d’ammoniac) et l’administration de sucres non absorbables, tels que le lactulose et le lactitol . Dans le gros intestin, le lactulose est décomposé par l’action des bactéries coliques, principalement en acide lactique, mais aussi en petites quantités d’acides formique et acétique. Cette acidification favorise la formation de l’ion ammonium non absorbable à partir de l’ammoniac et réduit sa concentration dans le plasma. Il n’est pas clair dans quelle mesure le nitrate alimentaire contribue à la concentration d’ammoniac dans l’intestin et le sang, cependant nous suggérons l’hypothèse alternative que l’acidification accrue du contenu colique due à la présence de lactulose favorise la conversion par le microbiote du nitrite en NO au lieu de l’ammoniac par le mécanisme connu dépendant de l’acide.

Conclusions

Pendant plus de 30 ans, le devenir biologique du nitrate exogène n’a pas pu être pris en compte dans les composés azotés excrétés qui représentent environ 60% d’une dose de nitrate ingérée chez l’homme. Nos résultats confirment l’idée que le nitrate est converti en nitrite puis en d’autres biomolécules azotées réduites telles que le NO, l’ammoniac, l’urée et éventuellement l’azote gazeux par des bactéries présentes dans la salive, l’estomac, l’intestin grêle et le gros intestin. Des questions telles que la quantité d’ammoniac générée par la réduction nitrate-nitrite par rapport à d’autres processus importants, tels que la désamination et l’activité des uréases bactériennes, nécessitent des études métaboliques détaillées chez les animaux et/ou les humains. L’importance biologique de la conversion des nitrates alimentaires au niveau de la lumière intestinale reste à établir. Néanmoins, les régimes traditionnels japonais et méditerranéens, dont on sait qu’ils ont des effets protecteurs sur le système cardiovasculaire, ont une consommation moyenne de nitrates par personne 2 à 3 fois plus élevée que le régime occidental typique (aux États-Unis, cela correspond à environ 40-100 mg/jour de nitrates). D’autres recherches sur le lien entre les bactéries symbiotiques, le métabolisme des oxydes d’azote et la santé humaine sont nécessaires ; cependant, il est clair que les voies biologiques du métabolisme de l’azote chez les mammifères sont plus complexes et plus importantes que ce qui était envisagé il y a quelques années.