RESULTATS ET DISCUSSION
Une lignée cellulaire de mélanome A375 avec un MAPK activé de manière constitutive en raison d’une mutation BRAFV600E a été traitée avec l’inhibiteur MEK U0126 à une concentration de 25 μM pendant 8 h, ce qui a entraîné la suppression de la phosphorylation ERK (Fig. 1 a). Les ARNm des facteurs solubles immunosuppresseurs, y compris l’IL-6, l’IL-10 et le VEGF, ont significativement diminué avec le traitement par l’U0126 (Fig. 1 b), alors que le traitement par le DMSO n’a pas affecté la production des ARNm de l’IL-10 et du VEGF, et n’a que légèrement augmenté le niveau de l’ARNm de l’IL-6. Une exposition de 18 heures à l’U0126 a également supprimé la production d’IL-10, de VEGF et d’IL-6 au niveau des protéines, indiquant que les ERK activés peuvent être responsables de la suppression des réponses immunitaires locales contre le mélanome en produisant ces facteurs immunosuppresseurs (Fig. 1 c). En outre, la suppression de la phosphorylation des ERK et l’inhibition de la production d’IL-6, d’IL-10 et de VEGF se sont produites même après avoir réduit la concentration du traitement par l’U0126 à 10 μM (non représenté). Au cours de cette étude, aucun effet cytotoxique significatif n’a été observé avec le traitement par l’U0126 des cellules A375. Bien que l’U0126 soit connu pour inhiber MEK5 en plus de MEK1/2, ERK5 phosphorylé, le substrat de MEK5, n’a pas été détecté dans les cellules A375 (non représenté), indiquant que la voie MEK1/2-ERK1/2 est responsable des effets observés avec le traitement U0126. Les effets suppressifs de l’U0126 sur la production d’IL-10 et de VEGF ont également été démontrés dans trois autres lignées cellulaires de mélanome avec la mutation BRAFV600E, 624mel, 888mel, et 928mel, sans aucune toxicité cellulaire significative (Fig. 1 d). Comme ces lignées cellulaires de mélanome ne produisent pas d’IL-6, la signalisation MAPK activée semble avoir un rôle général dans la production des facteurs immunosuppresseurs IL-10 et VEGF dans les lignées cellulaires de mélanome BRAFV600E+.
Diminution de la production des facteurs solubles immunosuppresseurs IL-6, IL-10 et VEGF à partir de lignées cellulaires de mélanome avec MAPK constitutivement actif par la mutation BRAFV600E par inhibition de la signalisation MAPK avec un inhibiteur MEK, U0126. (a) L’inhibition de la phosphorylation de ERK1/2 a été détectée par analyse Western blot de la lignée cellulaire de mélanome A375mel avec la mutation BRAFV600E avant et 2, 4, 6 et 8 h après traitement avec l’inhibiteur MEK U0126 à une concentration de 25 μM. (b) Inhibition de l’expression de l’ARNm des facteurs solubles immunosuppresseurs IL-6, IL-10 et VEGF dans les cellules A375. Les ARNm de divers facteurs solubles, notamment IL-6, IL-10 et VEGF, ont été mesurés par RT-PCR quantitative avant et 2, 4, 6 et 8 h après le traitement par U0126. Le traitement de contrôle a été effectué avec une solution de DMSO. Les niveaux d’ARNm à chaque point temporel ont été normalisés par rapport à l’ARNm GAPDH et indiqués comme valeur relative à celle de 0 h. (c) Diminution de la production des protéines IL-6, IL-10 et VEGF des cellules A375 après un traitement de 18 h avec U0126 à une concentration de 25 μM. L’expression a été détectée par ELISA avec les surnageants de culture. Le ratio de viabilité des cellules traitées par l’U0126 et par le DMSO à la récolte était de 77 %. La production de cytokines a été normalisée par rapport à la valeur des cellules témoins traitées au DMSO sur la base du nombre de cellules. Le Western blot a montré une forte inhibition de la phosphorylation de ERK, mais pas de la protéine STAT3, ni de sa phosphorylation à Ser727 et Tyr705. (d) Diminution de la production d’IL-10 et de VEGF de trois lignées cellulaires de mélanome avec la mutation BRAFV600E, 624mel, 888mel, et 928mel après un traitement de 18 heures avec U0126 à une concentration de 25 μM, qui a été détecté par ELISA avec les surnageants de culture. Les ratios de viabilité des cellules traitées par U0126 et DMSO à la récolte étaient de 95 % pour 624mel, 103 % pour 888mel et 100 % pour 928mel. La production de cytokines a été normalisée par rapport à la valeur des cellules témoins traitées au DMSO en fonction du nombre de cellules. Le Western blot a montré une forte inhibition de la phosphorylation de ERK, mais pas de la protéine STAT3. Une légère diminution de la phosphorylation Ser727 de STAT3 a été observée dans les cellules 888mel et 928mel, mais pas dans les cellules 624mel. Ces résultats sont représentatifs de trois ou quatre expériences indépendantes avec des résultats similaires.
Cependant, des effets non spécifiques de l’U0126 sur la production de cytokines via des voies autres que la signalisation MAPK ne peuvent pas être complètement exclus de ces expériences en raison de la légère diminution observée de la phosphorylation de STAT3 à Ser727 dans les cellules 888mel et 928mel (Fig. 1 d). Pour confirmer le rôle de la MAPK activée par la mutation BRAFV600E dans la production d’IL-10, de VEGF et d’IL-6, un ARNi spécifique de BRAFV600E a été transfecté dans trois lignées cellulaires de mélanome, A375, 888mel et 624mel, à l’aide d’un lentivirus exprimant un ARN en épingle à cheveux court (shRNA) spécifique de BRAFV600E (11). L’ARNi spécifique de BRAFV600E a considérablement inhibé la production d’IL-10, de VEGF et d’IL-6 et supprimé la phosphorylation de ERK (Fig. 2). Ces résultats confirment que l’inhibition de ces facteurs par l’U0126 (Fig. 1) est corrélée à l’inhibition spécifique de la voie MAPK. Ces résultats sont cohérents avec des articles récents montrant la production d’IL-10 induite par ERK1/2 dans les macrophages murins (12) et la production de VEGF dépendante de BRAFV600E pour la promotion de l’angiogenèse (13).
Diminution de la production des facteurs immunosuppresseurs IL-6, IL-10 et VEGF de trois lignées cellulaires de mélanome avec la mutation BRAFV600E par ARNi spécifique de BRAFV600E. Les trois lignées cellulaires de mélanome présentant la mutation BRAFV600E, A375mel, 888mel et 624mel, ont été infectées par des vecteurs lentivirus codant pour un ARN en épingle à cheveux courte pour l’ARNm de la luciférase de luciole (GL3B ; comme contrôle) ou l’ARNm de BRAFV600E (BRAF#1′) à une multiplicité d’infection de 50 ou 100. A 5 ou 6 d après l’infection, les protéines ont été extraites et soumises à une analyse Western blot. Une diminution profonde de la phosphorylation de ERK1/2 avec la diminution de la protéine BRAF a été observée par l’ARNi spécifique de BRAFV600E. Aucune différence significative dans la protéine STAT3 et la phosphorylation de STAT3 à Ser727 ou Tyr705 n’a été observée. Une légère diminution de la phosphorylation à Ser727 a été observée dans les cellules 888mel et 624mel après l’ARNi BRAF. 5 ou 6 jours après l’infection par le lentivirus, un nombre égal de cellules de mélanome a été distribué à une densité de 1-2 × 106 cellules/2 ml, et les surnageants de culture après 18 heures ont été soumis à un ELISA pour IL-6, IL-10 ou VEGF. Une forte diminution de l’IL-6, de l’IL-10 et du VEGF a été observée. Un résultat représentatif de deux ou trois expériences indépendantes avec des résultats similaires est présenté.
Parce qu’il a été déterminé que la signalisation STAT3 activée entraîne une évasion immunitaire du cancer par la production de divers facteurs dont le VEGF (8, 9), nous avons étudié la relation entre les voies MAPK et STAT3 concernant la production de facteurs immunosuppresseurs dans la lignée cellulaire de mélanome A375. La production de IL-6, IL-10 et VEGF a été profondément inhibée par l’ARNi ciblant soit BRAFV600E seul, soit STAT3 seul (Fig. 3 a). Aucun effet additif ou synergique clair n’a été observé en restreignant simultanément les voies BRAF-MAPK et STAT3 (Fig. 3 a). L’ARNi BRAFV600E dans les cellules A375 n’a pas diminué l’activité de liaison à l’ADN de STAT3 (Fig. 3 b), l’activité du promoteur STAT3 (Fig. 3 c) ou la phosphorylation de STAT3 au niveau de Ser727 ou Tyr705 (Fig. 2), bien que les ERK aient été signalés comme étant potentiellement capables de phosphoryler STAT3 au niveau de Ser727 (14). Cependant, la phosphorylation de STAT3 peut également se produire par une voie indépendante des ERK (15). Dans les cellules 624mel, malgré une légère diminution de STAT3 phosphorylé en Ser727, l’activité de liaison à l’ADN (Fig. 3 b) et l’activité du promoteur STAT3 (Fig. 3 c) n’ont pas été affectées par l’ARNi BRAFV600E (Fig. 2). Dans les cellules 888mel, on a observé une diminution similaire de la phosphorylation de Ser727, mais, inversement, l’activité de liaison à l’ADN de STAT3 (Fig. 3 b) et l’activité du promoteur STAT3 (Fig. 3 c) ont diminué après l’ARNi BRAFV600E (Fig. 2). Ces résultats suggèrent que la réduction de l’activité de transcription de STAT3 n’est pas le principal mécanisme générant la suppression du facteur immunosuppresseur par la régulation négative de la signalisation MAPK dans ces lignées cellulaires de mélanome.
Inhibition de la production d’IL-6, d’IL-10 et de VEGF dans les cellules A375 par l’ARNi pour BRAFV600E seul, STAT3 seul ou les deux, sans changement significatif de l’activité de liaison à l’ADN et de l’activité promotrice de STAT3. (a) Inhibition profonde de la production de IL-6, IL-10 et VEGF dans les cellules A375 par l’ARNi pour BRAFV600E seul, STAT3 seul ou les deux. 5 ou 6 jours après l’infection, un nombre égal de cellules a été distribué à une densité de 106 cellules/2 ml, et le surnageant de culture après 18 heures a été soumis à ELISA pour IL-6, VEGF, et IL-10. La diminution de BRAF et de ERK1/2 phosphorylé par l’ARNi spécifique de BRAFV600E et la diminution de STAT3 par l’ARNi spécifique de STAT3 ont été confirmées par analyse Western blot. Un résultat représentatif de six expériences indépendantes avec des résultats similaires est présenté. (b) Aucun changement significatif de l’activité de liaison à l’ADN de STAT3 par l’inhibition de la signalisation MAPK avec l’ARNi BRAF dans les lignées cellulaires de mélanome. L’activité de liaison à l’ADN de STAT3 a été examinée par EMSA des extraits nucléaires de lignées cellulaires de mélanome avec soit le contrôle GL3B, soit le traitement par vecteur BRAF#1′ shRNA. Les bandes STAT3 spécifiques indiquées par des flèches ont disparu avec la sonde ADN STAT3 de type sauvage à froid (wt), mais pas avec la sonde ADN STAT3 mutante (mt). Seule une légère diminution de l’activité de liaison à l’ADN de STAT3 a été observée dans les cellules 888mel. (c) Tests rapporteurs STAT3 dans les cellules A375, 624mel et 888mel. 2-4 × 105 cellules avec le contrôle ou l’infection du vecteur BRAF#1′ shRNA ont été transfectées avec 0,4 μg de pSTAT3-TA-Luc et 0,4 μg de pRL-SV40 avec le réactif de transfection Effectene. 24 h après la transfection, les cellules ont été récoltées et analysées pour l’activité luciférase de luciole et de renille. Chaque activité luciférase de luciole a été normalisée par rapport à l’activité luciférase de renille. Les barres ombragées et les barres d’erreur indiquent la moyenne et l’écart-type des essais triples, respectivement. Une expérience représentative de trois ou quatre expériences indépendantes est présentée. La transcription pilotée par STAT3 n’a pas été modifiée après l’ARNi BRAF dans A375 et 624mel, mais elle a légèrement diminué dans 888mel.
Puis, les effets potentiels causés par les facteurs solubles induits par la signalisation MAPK et STAT3 dans le surnageant des cultures A375 sur la maturation des DC ont été étudiés. Le surnageant des cultures de cellules de mélanome A375 contient des facteurs solubles qui inhibent la maturation des DCs humaines dérivées de monocytes (MoDC) lorsqu’elles sont stimulées par des ligands de récepteurs Toll-like tels que le LPS. L’ajout des surnageants de culture de l’A375 aux cultures de MoDC à une concentration finale de 10 à 20 % a diminué de manière significative la production de cytokines inflammatoires, notamment IL-12 et TNF-α, dans les MoDC ainsi que les molécules de surface cellulaire CD1a et CD83, mais pas CD80, CD86, CD40 ou HLA-DR sur les MoDC. Les surnageants des trois autres lignées cellulaires de mélanome ont produit les mêmes résultats lorsqu’ils ont été ajoutés aux cultures de MoDC (non représentés). L’activité suppressive des surnageants de cellules de mélanome provient de la production d’IL-6, d’IL-10 et de VEGF car l’ajout d’anticorps spécifiques pour ces facteurs a réduit l’activité suppressive des surnageants de culture d’A375 (Fig. 4 a). Les disparités entre nos observations et les résultats précédemment rapportés concernant le surnageant de cellules de mélanome murin B16 avec un STAT3 activé inhibant l’expression du CMH de classe II et du CD40 peuvent être expliquées par des cellules tumorales ou des espèces différentes (8).
Diminution de l’activité suppressive des surnageants de culture de mélanome A375 par prétraitement avec l’ARNi pour BRAFV600E seul, STAT3 seul, ou les deux sur la production d’IL-12 et de TNF-α induite par le LPS à partir des DCs. (a) La neutralisation de l’IL-6, de l’IL-10 ou du VEGF dans les surnageants de culture des cellules de mélanome A375 a rétabli l’inhibition de la production d’IL-12 par les DC humaines stimulées par le LPS. Les DCs humains ont été cultivés avec les surnageants d’A375 en présence ou en l’absence de l’anticorps monoclonal pour IL-6, IL-10, VEGF, ou d’un anticorps contrôle isotype à 1 μg/ml. La production d’IL-12 dans les surnageants de culture a été déterminée par ELISA 24 h après la stimulation par le LPS à 100 ng/ml. (b) Les monocytes CD14+ ont été isolés des PBMC par MACS et cultivés dans un milieu contenant RPMI 1640, 10% (vol/vol) de FBS, 100 ng/ml de GM-CSF, et 50 ng/ml d’IL-4 avec ou sans 20% (vol/vol) du surnageant de culture des cellules A375mel préparées dans la Fig. 3. (a) La moitié des milieux, des cytokines et du surnageant de culture a été changée tous les 2 jours. Au jour 5 de la culture, le LPS a été ajouté à 100 ng/ml. Après 15 h, les surnageants de culture ont été recueillis et soumis à un ELISA de l’IL-12 et du TNF-α.
L’activité suppressive des surnageants de culture A375 sur la production d’IL-12 et de TNF-α des MoDCs traités au LPS a été restaurée en prétraitant les cellules A375 avec un ARNi ciblant BRAFV600E seul, STAT3 seul, ou à la fois BRAFV600E et STAT3 (Fig. 4 b). Bien que l’ARNi de STAT3 ait semblé réduire davantage l’activité suppressive des surnageants de culture des A375 que l’ARNi de BRAFV600E, la différence peut être simplement due à des activités différentes de l’ARNi. Cependant, il est important de noter qu’aucun effet additif ou synergique de l’ARNi ciblant simultanément BRAF et STAT3 n’a été observé, ce qui indique à nouveau les rôles essentiels des deux voies de signalisation dans la production de facteurs de suppression de la maturation des DC. Bien que l’activation des DC par le surnageant de la lignée cellulaire murine CT26 du cancer du côlon transfectée avec une forme dominante-négative de STAT3, probablement par la production accrue de cytokines pro-inflammatoires, ait été rapportée, l’activation des DC n’a pas été observée dans cette étude. Cela peut s’expliquer par une inhibition incomplète de BRAF et STAT3, par l’absence de production accrue de cytokines pro-inflammatoires dans les cellules de mélanome transfectées par BRAF shRNA, ou par des différences entre les cellules tumorales ou les espèces.
En résumé, nous avons démontré pour la première fois un rôle essentiel de la signalisation MAPK avec la voie STAT3 sur la production de divers facteurs immunosuppresseurs dans les lignées cellulaires de mélanome avec MAPK constitutivement actif en raison de la mutation commune BRAFV600E. Ainsi, la voie MAPK peut être une cible moléculaire potentiellement importante pour surmonter l’évasion immunitaire de divers cancers car elle est fréquemment activée dans plusieurs types de cancers, y compris le mélanome sans mutation BRAFV600E (16, 17).