L’objectif global de cette procédure est d’extraire séquentiellement l’ARN et l’ADN de noyaux de tissus archivés fixés au formol et inclus en paraffine. Il s’agit d’un protocole de récolte de carottes de tissus à partir desquelles nous extrairons à la fois l’ARN et l’ADN. Le principal avantage de ce protocole est qu’il améliore les rendements en ARN et en ADN à partir de régions précisément ciblées dans le bloc de tissu.

Cette procédure est largement développée dans les tissus archivés du cancer de la prostate. Elle peut également être appliquée à d’autres types de tissus d’archives. La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle car les étapes de carottage des tissus ne sont pas couramment utilisées dans les laboratoires de recherche.

La plupart des laboratoires de recherche utilisent plutôt des coupes transversales, ce qui épuise les tissus plus rapidement et ajoute une hétérogénéité importante à l’échantillon. Commencez par examiner la lame de microscope et dessiner la région d’intérêt à l’aide d’un marqueur permanent à pointe fine. Ensuite, coupez une section de film de paraffine suffisamment grande pour couvrir la région d’intérêt sur la lame de microscope.

Puis, placez fermement le film sur la lame, en enveloppant le film sur les bords pour l’empêcher de glisser. A l’aide d’un marqueur permanent à pointe fine, tracez le contour du tissu entier et de la région d’intérêt à l’intérieur du tissu. Ensuite, retirez le film de la lame et transférez-le sur le bloc de tissu correspondant.

Orientez le film en le retournant ou en le faisant tourner de façon à ce que le contour du tissu entier corresponde à la forme observée du tissu dans le bloc. Appuyez fermement la section du film sur la surface du bloc pour éviter tout glissement. À l’aide de la pointe du marqueur permanent, faites des indentations peu profondes mais visibles le long du contour de la région d’intérêt, puis retirez le film.

Puis, nettoyez le poinçon récepteur du jeu de poinçons de 0,6 millimètre en immergeant la pointe dans un micro tube de centrifugation de 1,5 millilitre contenant un millilitre d’eau de Javel et en faisant glisser le poinçon de haut en bas plusieurs fois. Répétez le lavage avec le tube contenant de l’éthanol à 70 %, puis de l’eau. Enfoncer maintenant le poinçon nettoyé dans la région d’intérêt à une profondeur de trois millimètres et retirer.

Libérer la carotte dans un tube de micro centrifugeuse à faible liaison en la poussant hors du poinçon avec le stylet. Ajoutez un millilitre de xylène aux tubes micro centrifuges contenant les carottes de tissus et agitez vigoureusement pendant dix secondes. Placer ensuite dans un bloc thermique réglé à 50 degrés Celsius pendant trois minutes.

Après l’incubation, centrifuger pendant deux minutes à température ambiante à vitesse maximale. Après la centrifugation, placez les noyaux sur la glace pendant cinq minutes pour solidifier le résidu cireux. Maintenant, retirez soigneusement la paraffine qui s’est accumulée autour du ménisque avec le surnageant en utilisant un embout de pipette.

Puis, répétez le traitement au xylène. Après avoir retiré le mélange paraffine xylène, ajouter un millilitre d’éthanol à 100 pour cent et vortexer vigoureusement pendant dix secondes. Après avoir centrifugé à la vitesse maximale pendant deux minutes, jetez soigneusement l’éthanol.

Répétez le lavage à l’éthanol une fois de plus avant de commencer l’homogénéisation. Remettre en suspension les noyaux déparaffinés dans 700 microlitres d’éthanol à 100 % avant l’homogénéisation. Utilisez un homogénéisateur de tissus motorisé sur un réglage moyen pour broyer les noyaux en fines particules.

Une homogénéisation minutieuse des noyaux de tissus est nécessaire pour un rendement optimal en ADN et en ARN. Ensuite, remplissez des tubes séparés de 15 millilitres avec environ dix millilitres d’eau de Javel, de solution neutralisante de RNase et d’éthanol à 70 %. Après l’homogénéisation des échantillons, laver la sonde de l’homogénéisateur dans chacune des solutions de nettoyage dans l’ordre.

Faire fonctionner l’homogénéisateur à la vitesse la plus élevée pendant l’étape de lavage. Essuyez la sonde avec un mouchoir en papier et laissez la sonde sécher complètement avant d’homogénéiser l’échantillon suivant. Inspectez visuellement les lames de la sonde à la recherche de morceaux de tissus résiduels et si vous en trouvez, nettoyez à nouveau la sonde.

Après l’homogénéisation, amenez le volume de l’échantillon à un millilitre avec de l’éthanol à 100 %, puis centrifugez à la vitesse maximale pendant 15 minutes. Aspirer soigneusement l’éthanol et sécher à l’air les culots pendant environ 15 à 20 minutes avant de commencer l’extraction à la protéinase K. Remettre en suspension les culots dans 150 microlitres de tampon de digestion de la protéinase K et agiter les tubes pour détacher le culot.

La digestion de la protéinase K pendant la nuit est recommandée pour une récupération d’ADN plus élevée. Ajouter 10 microlitres de protéinase K stable en température et mélanger par pichenette. Incuber à 56 degrés Celsius pendant 15 minutes en agitant légèrement.

Incuber les tubes sur la glace pendant trois minutes. Après refroidissement, centrifuger le tube pendant 15 minutes à la vitesse maximale. Ensuite, sans déranger les culots, transférez soigneusement chaque surnageant dans un nouveau tube de microcentrifugation pour la purification de l’ARN.

Extraire l’ARN et l’ADN en utilisant la procédure optimisée du protocole écrit, qui comprend un temps de digestion du tissu prolongé pour l’extraction de l’ADN. L’ARN et l’ADN peuvent être récupérés à partir d’échantillons de tissus plus anciens fixés au formol et inclus en paraffine en utilisant cette méthode. Les acides nucléiques ont été coextraits d’échantillons de cancer de la prostate dont l’âge variait de trois à 14 ans.

Le rendement moyen était de 2, 270 nanogrammes d’ARN et 820 nanogrammes d’ADN. Il est intéressant de noter qu’il n’y avait pas de corrélation significative entre l’âge de l’échantillon de tissu et la récupération des acides nucléiques. Dans l’ensemble, les rendements en ARN et en ADN étaient corrélés entre les échantillons, bien que dans la plupart des cas, plus de deux fois plus d’ARN ait été récupéré par rapport à l’ADN.

Pour démontrer la performance de l’ADN génomique extrait avec ce protocole, des extraits d’ADN convertis au bisulfite provenant d’échantillons de cancer de la prostate archivés ont été amplifiés par PCR spécifique de méthylation. Les éléments répétitifs ALU ont été utilisés comme contrôle de méthylation et ont montré peu de variation entre les échantillons. GSTP1, un gène connu pour être hyper-méthylé dans le cancer de la prostate, n’a montré aucune amplification détectable par PCR spécifique de méthylation lorsque de l’ADN extrait d’échantillons bénins a été utilisé.

Les échantillons d’ADN provenant de patients atteints d’un cancer de la prostate agressif ont présenté des valeurs de seuil de cycle QPCR détectables qui étaient inférieures à celles des cellules de cancer de la prostate indolent, indiquant une méthylation accrue de GSTP1 dans le cancer de la prostate agressif. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en trois ou quatre heures pour l’ARN, et après une digestion de nuit, en quatre heures pour l’ADN si elle est effectuée correctement. Cette technique devrait permettre aux chercheurs en pathologie moléculaire d’explorer les biomarqueurs diagnostiques d’ADN et d’ARN dans une variété de cancers.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de préparer des carottes de tissus pour l’extraction d’ADN et d’ARN à partir de zones d’intérêt précisément cartographiées dans des blocs de tissus d’archives.