Mathis a commencé à jouer la comédie professionnellement à l’âge de 16 ans. Son premier emploi a été une publicité pour “Always Slender Pads – Just For Teens”. Elle a joué dans les séries télévisées Aaron’s Way et Knightwatch de 1988 à 1989. Son premier rôle principal dans un long métrage est celui de Nora dans Pump Up the Volume (1990), face à Christian Slater, qu’elle a brièvement fréquenté à l’époque. Mathis a teint ses cheveux blonds naturels en noir pour le rôle dans le but de changer son image de douce et innocente à forte volonté.

Mathis est apparue dans les téléfilms Extreme Close-up, 83 Hours ’til Dawn, et To My Daughter en 1990. Mathis et Slater ont eu des rôles de voix dans le film d’animation FernGully : The Last Rainforest (1992). Elle apparaît ensuite dans la comédie This Is My Life (1992), écrite et réalisée par Nora Ephron, où elle joue le rôle d’une adolescente peu sûre d’elle. Mathis a joué dans la pièce Fortinbras à New York en octobre 1992. Super Mario Bros (1993), dans lequel elle joue le rôle de la princesse Daisy du jeu vidéo populaire de Nintendo, a été un bide au box-office mais a gagné un culte depuis sa sortie.

Mathis a rencontré l’acteur River Phoenix sur le tournage de The Thing Called Love (1993) et les deux ont commencé une relation. Elle était avec Phoenix le 31 octobre 1993, la nuit où il est mort à l’hôpital Cedars-Sinai d’une overdose de drogue après s’être effondré à l’extérieur du Viper Room de West Hollywood. Elle a fait le film Jack and Sarah (1995), qui a été tourné à Londres, afin de sortir du pays après sa mort en raison de la couverture médiatique excessive.

Mathis est apparue dans l’adaptation cinématographique de 1994 de Little Women, et dans How to Make an American Quilt (1995), tous deux avec Winona Ryder. Elle est ensuite apparue dans The American President (1995), jouant l’assistante du président des États-Unis. Mathis a retrouvé Christian Slater, ainsi que John Travolta, dans Broken Arrow (1996) de John Woo. Elle a pris un peu plus d’un an de repos après le décès de sa mère en 1996 des suites d’un cancer du sein.

Mathis est ensuite apparue dans American Psycho (2000), une adaptation cinématographique du roman éponyme de Bret Easton Ellis (1991). Elle a joué dans Attraction (2000), et dans La ligne simienne (2001). Elle a joué dans la mini-série télévisée de TNT The Mists of Avalon (2001). Mathis a joué avec Thomas Jane dans The Punisher (2004). Elle a joué le rôle d’Olivia Goodspeed dans la série télévisée Lost sur ABC. Elle a joué le rôle de la fille de Jane Fonda dans le spectacle de Broadway “33 Variations”. Son film indépendant Lebanon, PA a été présenté en première mondiale au festival du film SXSW 2010. Elle est apparue dans une production off-Broadway de la pièce, Love, Loss, and What I Wore, au Westside Theatre de New York en octobre 2011.

En 2013, Mathis a joué le rôle de la psychiatre Alice Calvert dans la série télévisée Under the Dome de CBS, basée sur un roman de Stephen King. En 2014, elle a rejoint le casting de la série dramatique d’horreur The Strain de FX en tant que Justine Feraldo, une conseillère municipale de New York pour Staten Island.

En 2019, Mathis est apparue Off-Broadway dans le rôle de Kate Conlee dans Make Believe, une nouvelle pièce de Bess Wohl mise en scène au Second Stage Theater. Michael Greif a mis en scène.

Sa comédie musicale de 2020, Whisper House, a été reportée en raison de la pandémie de COVID-19.