Az ammónium-acetát pufferek számos problémát okozhatnak a laboratóriumban. Két gyakori probléma a HPLC-MS ellennyomás meglepő emelkedése a műszer éjszakai tárolás utáni indításakor és az MS érzékenységgel kapcsolatos nehézségek.
A műszer ellennyomásának emelkedése ammónium-acetát (és ammónium-formiát) használatakor gyakori probléma, amelyet kromatográfiai fórumokon találtak, különösen akkor, ha a műszer egy éjszakán át állt vagy minden nap első néhány futásakor. A magas oldhatóságú vizes pufferek sok fejvakarást okozhatnak. A gyakorlati használatban problémássá válnak, eltömítik a kapillárisokat, előoszlopokat és az analitikai oszlopvég fritteket.
Ezek a problémák kivétel nélkül a puffer oldhatóságának félreértéséből erednek a kevert szerves vizes közegekben. Ez az 1. ábrán látható adatok segítségével kiküszöbölhető.
1. ábra: Öt puffer oldhatósága acetonitrillel keverve. (Adaptálva az 1. hivatkozás engedélyével)
Az 1. ábra jól mutatja, hogy az ammónium-acetát oldhatósága 90% feletti acetonitrilt tartalmazó bináris keverékekben egyre korlátozottabban oldódik, és 100%-os acetonitrilben teljesen oldhatatlan. Míg 90%-os acetonitrilnél 20 mM ammónium-acetát az oldhatósági határ, addig 95%-os acetonitril keverékeknél ez a határ meredeken lecsökken 10 mM ammónium-acetátra (az LC-MS alkalmazásoknál használt népszerű pufferkoncentráció). Ezen oldhatósági határok túllépése az oldatban lévő finom ammónium-acetát csapadék miatt zavaros folyadékot eredményez. Ez eltömítheti a kapillárisokat és az oszlopfritteket, ami a rendszer ellennyomásának növekedését okozza. Azt is meg kell jegyezni, hogy az 1. ábra adatai jó minőségű puffersó felhasználásával származnak – az oldhatóság csökken, ha rosszabb minőségű (tisztaságú) puffersó-reagenseket használnak. Kerülje az ammónium-acetát tiszta acetonitrilben való feloldásának kísérletét, még akkor is, ha az oldathoz ekkor esetleg vizet adnak. Bár kezdetben úgy tűnhet, hogy a puffer oldódik, gyorsan kiesik az oldatból (2. ábra).
2. ábra: Ammónium-acetát maradék, amely az ammónium-acetát acetonitrilben való “feloldásakor”, majd víz hozzáadásával keletkezik az eluens kívánt szerves/vizes arányának elérése érdekében (A fényképet dr. Paul Ferguson, Astra Zeneca, Egyesült Királyság).
Egy tipikus fordított fázisú HPLC gradiensben ez talán nem jelent akkora problémát, kivéve persze, ha a gradiens >90%-os acetonitrilre megy. Vannak azonban más megfontolások is, mint például a szerves oldószer relatív százalékos aránya, amellyel a vizes puffer találkozhat alacsony vagy magas nyomású keverőrendszerekkel történő keveréskor, magas százalékban acetonitrilben oldott minták injektálásakor, vagy a legrosszabb esetben, amikor a rendszereket 100%-os acetonitrillel öblítik az oszlop szennyeződéseinek eltávolítása vagy az éjszakai tárolás miatt.
A 100%-os acetonitril oszlop tárolására történő alkalmazásakor további szempont, hogy 100%-os szerves oldószerben nagy pH-eltolódások fordulhatnak elő, és figyelni kell arra, hogy ezek a pH-eltolódások az oszlop tárolási pH-ját olyan tartományba hozzák-e, ahol a szilikamátrix feloldódása lehetséges, ami az oszlopon belül “finomszemcsék” kialakulásához vezet, ami végül az oszlop eltömődéséhez (magas pH-nál) vagy a kötött fázisú ligandumok eltávolításához (alacsony pH-nál) vezet.
Ammónium-acetát mint puffer
Sokan választják az ammónium-acetátot pufferként, különösen MS detektálás alkalmazása esetén, a velejáró illékonysága és az API-forrás szennyeződésére való alacsony hajlam miatt. Vegyük azonban figyelembe ezt a korlátozott oldhatóságot, és a HPLC-gyakorlatunkat ennek megfelelően igazítsuk ki. Értse meg, hogy az ammónium-acetát használata megfelelő-e a kísérlethez, és hogy valóban szükség van-e pufferre. A puffer használatára vonatkozó követelményeket, valamint a puffer megfelelő kiválasztását és koncentrációját gyakran félreértik. Az ammónium-acetát a példa arra, hogy megvizsgáljuk ennek a közkedvelt pufferrendszernek a felhasználását és visszaéléseit.
A pufferekre azért van szükség, hogy ellenálljanak a pH (elsősorban az eluens) kis változásainak, és hogy biztosítsák, hogy a HPLC-oszlop állandó töltésű maradjon (elsősorban a szilícium-dioxid-tartó felületén maradó szilanolfajok ionizációs állapota). A pH változása problémákat okozhat a retenciós idő stabilitásában, a csúcsok alakjában és (Electrospray MS használata esetén) a műszer érzékenységében. Általában a rendszer pH-ját érintő legnagyobb “kihívást” a minta hígítószerének az eluenssel való keveredése jelenti az injektor és a HPLC-oszlop (vagy előoszlop) közötti kötőelemekben és az oszlop fejénél. Ha a minta hígítójának eltérő pH-ja van, akkor az analit (vagy az analitmolekulák egy része) megváltoztathatja ionizációs állapotát, és ennek következtében másképp kromatografálódhat, vagy másképp reagálhat az MS-interfészen. Az analitikai módszerünk kémiájának megértése azonban fontos ahhoz, hogy kritikus döntéseket tudjunk hozni a puffer típusával és koncentrációjával kapcsolatban. Az analitkoncentrációk és a pH-szabályozást igénylő oszlopfelület mennyisége elég alacsony ahhoz, hogy csak nagyon alacsony pufferkoncentrációra legyen szükség a reprodukálható retenciós idők, az elfogadható csúcsforma és a detektálási érzékenység fenntartásához.
A 3. ábra jelzi azokat a helyzeteket, amelyekben az ammónium-acetát mind a kromatográfiában, mind a tömegspektrometriában hasznos lehet.
3. ábra: A pufferkapacitás változása vizes ammónium-acetát oldat (10 mM) különböző arányú acetonitril (%) hozzáadásával (Adaptálva a Ref. engedélyével. 2)
Lényegében két pufferterület van, amikor 10mM ammónium-acetátot adunk az eluens oldatunkhoz, és vagy híg ammóniát vagy hangyasavat használunk a pH beállítására. A sav vagy bázis hozzáadása nélkül az oldat pufferkapacitása nagyon kicsi lesz.
A 100%-os vizes oldatban a puffer pKa értékei 4,8 és 9,5 körül vannak. A puffer a puffer pKa értékétől +/- 1 pH-egység körül használható a legjobban, ahol a pufferkapacitás körülbelül 66%-ra csökken. A puffer pKa értékétől 2 pH egységgel távolabb a pufferkapacitás 5% körüli értékre csökken. A vízben lévő ammónium-acetát puffer esetében az elválasztáshoz használt eluens pH-értéke 3,8-5,8 kell, hogy legyen, ha hangyasavat használunk pH-módosítóként, és 8,5-10,5, ha ammóniát használunk az eluens pH-értékének beállításához. A figyelmeztetés: amint acetonitrilt adunk a rendszerhez, ez a működési tartomány megváltozik, és a használható pH-tartomány 5,2 és 7,2, illetve 7,9 és 9,9 között lesz 60%-os acetonitril mellett. Gradiens elválasztások esetén a pufferrendszer pKa értéke folyamatosan változik. A rendszer pKa értékét a kiindulási gradiens összetételénél a puffer elválasztáshoz való használhatóságának becslésére használjuk.
Elégségesek lesznek ezek a pH-tartományok ahhoz, hogy elkerüljük az analit ionizáció mértékének változását vagy az oszlop protonálódásának változását? Ez a kulcskérdés.
MS detektáláshoz az ionizált formában lévő ionogén analitok jó detektálási érzékenységet eredményeznek, miközben a fordított fázisú retenciót az állófázis és a szerves oldószer típusának és összetételének megfontolt megválasztásával kezelik. Ha az analit a fent javasolt pH-tartományokban (és a 3. ábrán) teljesen ionizálódik, akkor jó kromatográfiás és detektálási teljesítményt fog eredményezni. Vegyük észre az 1. ábrán, hogy a rendszer pufferkapacitása az acetonitril hozzáadásával csökken, a pufferkapacitás a vizes érték 30%-ára csökken 60%-os acetonitril mellett. Az LC-MS pufferhasználatának legfontosabb elve, hogy a lehető legkevesebbet kell használni a retenciós idő reprodukálhatóságának, a csúcsok elfogadható alakjának és a detektor érzékenységének fenntartása érdekében. A puffer koncentrációja közvetlenül befolyásolja a tapasztalt ionszuppresszió mértékét, és ezért közvetlenül befolyásolja a módszer érzékenységét. A jó pufferkapacitás fenntartása érdekében alacsonyabb pufferkoncentrációknál gyakran arra törekszünk, hogy a puffer pKa értékének +/- 0,5 egységén belül dolgozzunk.
Az 1. táblázat mutatja azokat az ajánlott pH-tartományokat, amelyekben az ammónium-acetát pufferek hasznosak lehetnek.
| % MeCN | Maximális pufferkapacitási tartomány (ecetsav / acetát) | Maximális pufferkapacitási tartomány (ammónium / ammónia) | Pufferkapacitás (% a 100%-os Aq oldathoz képest) |
| 0 | 4.2 – 5.2 | 9.0 – 10.0 | 100 |
| 20 | 4.7 – 5.7 | 8.7 – 9.7 | 80 |
| 40 | 5.0 – 6.0 | 8.5 – 9.5 | 50 |
| 60 | 5.6 – 6.6 | 8.3 – 9.3 | 30 |
1. táblázat: Ajánlott pH-munkatartományok és indikatív relatív pufferkapacitások 0,1 mM ammónium-acetát (aq) / acetonitril eluens rendszerekhez.
Az 1. táblázat puffertartományait használjuk az eluens pH-értékének kiválasztásához, amelyben az analitnek 100%-ban ionizálódnia kell. Vegye figyelembe, hogy az ezen értékek levezetéséhez használt pufferkoncentráció 0,1 mM – ez a pufferkoncentráció népszerű választás MS-detektálás esetén. Bázikus analitok esetében az ecetsav/acetát pufferrendszer az általános, és az eluens pH-ja általában jóval a bázikus analit pKa értéke alatt van, biztosítva, hogy folyamatosan protonálódjanak. Ugyanez igaz lehet a savas analitekre is az ammónium/ammónia rendszerrel, ahol a savas analiteknek mind teljesen deprotonáltnak kell lenniük. Ez biztosítja, hogy a retenciós idők egyenletesek, a csúcsok alakja egészséges, és hogy az MS érzékenysége a módszer kémiája szempontjából optimális legyen.
Az ammónium-acetát alapú eluensek hatékony pufferelési tartományaiban nagy hiányosságok vannak. Azaz 20%-os acetontril eluens-összetétel (vagy 20%-os acetonitril kiindulási gradiens-összetétel) esetén valószínűleg alacsonyabb pufferkapacitással kell számolni (magasabb pufferkoncentrációkat kell használni) 4,2 alatti, 5,2 és 9,0 közötti vagy 10,0 feletti pH-értékű eluens esetén. Vannak más módszerek is, ahol az eluens pH-ját ezeken az ajánlott tartományokon kívül kell beállítani ammónium-acetát pufferek használata esetén. Fontolja meg egy másik pufferrendszer használatát – a 4,2 alatti eluens pH-értékeknél a formiát/ hangyasav rendszer népszerű választás
Mindig puffert kell használni?
Ha az eluens pH-értéke messze van az analit pKa értékétől, az eluens pH-értékének kis változásai elhanyagolható hatással lesznek az analit ionizációjának mértékére. Ilyen körülmények között szükségtelen lehet puffer használata. Például az ecetsav (valamint a hangyasav, trifluor- és difluor-ecetsav) jelentős “önpufferelő” kapacitással rendelkezik alacsony pH-n, és a bázikus analit pKa >2 pH-egységgel magasabb, a savas analit pKa
Mindez azt feltételezi, hogy a bázikus analitokat savas eluensrendszerrel, a savas analitokat pedig bázikusabb eluensrendszer pH-jával elemzik a teljes ionizáció és a jó elektrospray MS érzékenység biztosítása érdekében. Ha a műszer ellennyomásával, a retenciós idő instabilitásával vagy az MS detektálás érzékenységével kapcsolatos problémák merülnek fel, akkor érdemes megfontolni, hogy egyáltalán szükség van-e puffer-sóra. A hangyasav, ecetsav vagy ammóniaoldat megfontolt használata megoldhatja a problémákat.
Bármelyik esetről is legyen szó, szánjon időt arra, hogy megértse a módszer kémiáját az analit pKa értékével, a szükséges eluens pH értékével és a rendszerben e pH érték eléréséhez és fenntartásához használt pufferrendszer kiválasztásával kapcsolatban.
Azok számára, akik nem rendelkeznek az analit pKa értékével kapcsolatos információkkal, számos ingyenes program áll rendelkezésre, amelyek megfelelő munkát végeznek az analit pKa értékének szerkezet alapján történő előrejelzésében. A laboratóriumainkban széles körben használt programok:
- ChemSketch – https://www.acdlabs.com/resources/freeware/chemsketch/
- MarvinSketch – https://chemaxon.com/products/marvin
Ha a pufferekről és azok HPLC-ben és LC-MS-ben való felhasználásáról szeretne mélyebb ismereteket szerezni, olvassa el a 3-6. hivatkozásban található cikkeket.
Solubility of Buffers in Aqueous-Organic Eluents for Reversed-Phase Liquid Chromatography, Adam P. Schellinger és Peter W. Carr, LCGC North America Volume 22 Number 6 June 2004
Buffer Considerations for LC and LC-MS, Xavier Subirats, Elisabeth Bosch, and Marti Rosés, LCGC North America Volume 27 Number 11 November 2009
Mobile-Phase Buffers, Part I – The Interpretation of pH in Partially Aqueous Mobile Phases, LCGC North America Volume 20 Number 11 November 2002
Mobile-Phase Buffers, Part II – Buffer Selection and Capacity, LCGC North America Volume 20 Number 12 December 2002
Mobile-Phase Buffers, Part III – Buffer Selection and Capacity, LCGC North America Volume 21 Number 1 January 2003
Mobile-Phase Buffers in LC: A pufferkészítési módszer hatása a visszatartás megismételhetőségére, LCGC North America 37. kötet, 7. szám, 2019. július