3.1 Endogén halenzimek
Amint azt fentebb tárgyaltuk, a halak zsigerekben, emésztőrendszerében és izomszövetében különböző proteolitikus enzimek találhatók.
A szardellában a legfontosabb endogén proteinázok a tripszinszerű proteináz, pepszin, kimotripszin, elasztáz és aminopeptidáz voltak (Martinez & Serra, 1989; Siringan, Raksakulthai, & Yongsawatdigul, 2006). Az emésztőenzimek közül a tripszin, a kimotripszin és a pepszin a három legfontosabb enzimnek tekinthető a többihez képest (de la Parra, Rosas, Lazo, & Viana, 2007). A pepszin általában a halak gyomrában található, és az emésztőnedvek egyik fő enzimje (de la Parra et al., 2007). A tripszin a zsigerekben, a pylorus caeca és a lépben van jelen (Kishimura, Hayashi, Miyashita, & Nonami, 2005, 2006; Kishimura et al., 2007; Klomklao et al., 2006). A halak és kagylók emésztőszerveinek hepatopankréja peptidáz és proteináz aktivitásokat is tartalmaz, mint például aminopeptidáz, zselatinolitikus proteázok, tripszin és kimotripszin, valamint kollagenolitikus proteázok (Sriket, 2014).
A peda feldolgozása során megállapították, hogy a legtöbb lipolízis és proteolízis aktivitást a bélben mérték, különösen az erjesztési folyamat kezdetén, azonban az aktivitások a folyamat során gyorsan csökkentek (Irianto, 1990). Tekintettel arra, hogy az enzimek a zsigerekben és az emésztőrendszerben találhatók, a kizsigerelés fontos szerepet játszik az enzimes lebontás sebességének és típusának meghatározásában. Az egész hal felhasználásával feldolgozott fermentált haltermékek más tulajdonságokkal rendelkeznek, mint a fejtett és kibelezett halakból előállítottak (Wheaton & Lawson, 1985). A halakból származó legtöbb zsigeri és emésztőrendszeri enzim enzimatikus aktivitása közel semleges pH-értékek mellett volt a legnagyobb (Bougatef et al., 2007; Munilla-Moran & Saborido-Rey, 1996).
Castillo-Yañez, Pacheco-Aguilar, Garcia-Carreño és Toro (2004) izoláltak egy savas proteolitikus enzimet, amely az aszparagin proteáz osztályba tartozik a szardínia zsigeréből. Az enzim hasonló a más halfajokból származó pepszin II-hez és stabil pH 3-6 és 45°C-on.
A pylorus caeca képviseli azokat a szerveket, amelyek a lúgos proteinázok fő forrását jelentik. A tőkehal (G. morhua) pylorus caeca-jából nyert tripszinszerű enzim izoelektromos pontja 5,30 és 5,89 volt, és aminosav-összetételét tekintve nagyon hasonló volt a szarvasmarha-tripszinhez, de abban különbözött, hogy a savas aminosavak relatív mennyisége magasabb, a bázikus aminosavaké pedig alacsonyabb volt. Az enzim halfehérje szubsztrátokat is hidrolizált (Beirão, Mackie, Teixeira, & Damian, 2001).
Három alkalikus proteinázt és két savas proteinázt izoláltak szardíniából. A lúgos proteinázok mindegyike gyorsabban hidrolizálta a kazeint, mint más fehérjéket. Egy fő alkáli proteináz (III) ötször gyorsabban hidrolizálta a szardínia szarkoplazmás fehérjéit, mint a többi alkáli proteináz. Két savas proteináz mindegyike gyorsabban hidrolizálta a hemoglobint és a mioglobint, mint a többi fehérjét. 25%-os NaCl előinkubálás után egy lúgos proteináz (III) és egy savas proteináz (II) stabil volt, míg a többi proteináz instabillá vált. A két proteináz, a III. alkáli proteináz és a II. savas proteináz a halszószgyártás megkezdése után 3 hónapig is stabil volt. A lúgos és a savas proteinázok mindegyikének proteolitikus aktivitását 15%-nál több NaCl erősen gátolta; a minimális gátlást azonban akkor figyelték meg, amikor szardínia izomfehérjét használtak szubsztrátként (Noda, Van, Kusakabe, & Murakami, 1982).
Két aminopeptidázt (I és II) extraháltunk szardínia zsírtalanított belső szerveiből, és DEAE-cellulóz kromatográfiával, Sephadex G-200-on végzett gélszűréssel és izoelektromos fókuszálással tisztítottuk. Az I és II enzimek végleges készítményeit poliakrilamid gélelektroforézissel közel homogénnek ítélték. Az I és II enzimek molekulatömegét gélszűréssel 370 000, illetve 320 000 molekulatömegnek határozták meg. Az izoelektromos pont 4,1 (I), illetve 4,8 (II) volt. Mindkét enzimet gátolta az EDTA és aktiválta a Co++. A bestatin képes volt gátolni az I enzimet, de a II enzimet nem. Az I és II enzimek nemcsak az alanin vagy leucin tartalmú szintetikus szubsztrátokat hidrolizálták gyorsan, hanem a di-, tri- és tetra-alanint is. Mindezen jellemzők alapján a szardínia aminopeptidázok hasonlítanak a humán alanin aminopeptidázra. Az I enzim 15% NaCl-ban megtartotta eredeti aktivitásának több mint 70%-át, ami arra utal, hogy az enzim részt vesz a halfehérjék és peptidek hidrolizálásában a halszószgyártás során (Vo Van, Kusakabe, & Murakami, 1983).
A lúgos és savas proteinázok aktivitását összehasonlították a szarvasmarha tripszinnel és pepszinnel, és kimutatták, hogy a szarvasmarha tripszinhez hasonlóan a szardínia pylorus caeca-jából származó lúgos proteináz is hatékonyabban hidrolizálta a kazeint, mint más fehérje szubsztrátokat (Noda et al., 1982).
Az izomszöveti enzimek, különösen a kathepszinek, peptidázok, transzaminázok, amidázok, aminosavdekarboxilázok, glutamin-dehidrogenázok és rokon enzimek mind megtalálhatók a halak izomszövetében (Chaveesuk, 1991), és ezek az enzimek, különösen a tripszin, a kimotripszin és a kathepszin, részt vesznek a fehérjék hidrolízisében a halszósz fermentációja során (Fernandes, 2016). Az izomszöveti enzimek többnyire a sejtekben helyezkednek el. Ezzel szemben az emésztőenzimek exocelluláris szekréciót képeznek. Bár néhány tanulmány kimutatta, hogy az izomszöveti enzimek optimális aktivitása semleges pH-nál van, a legtöbb jelentés arról tájékoztat, hogy az alacsony pH-értékek felgyorsítják az izomszöveti enzimek aktivitását. A legtöbb erjesztett halterméket 4 feletti pH-n dolgozzák fel, kivéve a halszilázsokat és néhány erjesztett halterméket. Ennek megfelelően a legtöbb izomszöveti enzim valójában nem optimális pH-állapotban van (Mackie et al., 1971).
A lómakréla izomzatából származó kathepszin B részleges jellemzése a többi kathepszin BS-hez hasonló tulajdonságokat mutatott. A kathepszin optimális pH-értéke 5 volt, optimális hőmérséklete 50°C volt. Az aktivitást gátolta az E-64, a CA-074 és a kimosztatin (Yoshida et al., 2015).
A maximális enzimaktivitást egész halak felhasználásával lehet elérni, beleértve a fejeket és a zsigereket is. Ezzel szemben a minimális enzimaktivitás akkor jelentkezik, ha fejtelenített és kibelezett halakat használnak fermentált haltermékek előállításához. Eközben közepes enzimaktivitás érhető el, ha a belsőségeket a halak kifogása után bármikor eltávolítják, hogy a zsigeri enzimek némi diffúzióját lehetővé tegyék a szövetekbe (Owens & Mendoza, 1985).
A sózott halak érését három hipotézissel írják le. Ezek a következők: (1) mikrobiológiai elmélet, (2) autolitikus elmélet és (3) enzimelmélet. A mikrobiológiai elmélet szerint a mikroorganizmusok termelik az alapvető aktív enzimeket, és ezek az enzimek behatolnak a húsba, és hozzájárulnak az érési folyamathoz. Az autolitikus elmélet leírja, hogy az érés az izmok vagy más szövetek, illetve a gyomor-bélrendszer enzimeinek aktivitásának eredménye. Végül az enzimelmélet úgy magyarázza a sózott halak érését, hogy az bizonyos enzimek, nevezetesen az izomszövetben, a hal bélrendszeri szerveiben található enzimek, valamint a mikroorganizmusok által termelt enzimek hatására történik (Mackie et al., 1971).
A szardella érlelése során az indiai szardella (Stolephorus indicus) maximális autolitikus aktivitását 60°C-on találták. Az autolitikus aktivitás a NaCl-koncentráció növekedésével csökkent. A nyers kivonat optimális pH-értéke 8,5-9,5 volt. A nyers kivonatban a tripszinszerű proteinázok voltak a domináns proteinázok. Az indiai szardellából származó proteinázok részt vehetnek a fehérjék hidrolízisében a halszósz fermentációja során. Ezért az indiai szardella 60°C-on és 10%-os NaCl-ban történő inkubálása egy ideig, mielőtt 25%-os NaCl-on teljes mértékben besózzák, hatékony módja lehet a halszósz erjedési folyamatának felgyorsítására (Siringan és mtsai., 2006).