Abstract

A cink, magnézium és kalcium hatása az ondóplazmában a terhességig tartó időre (TTP) egészséges pároknál, a hagyományos sperma paraméterekre és a számítógépes spermaelemzés (CASA) paramétereire. A kelatizálható cinkionok lokalizációját az ondóplazmában és a spermiumokban autometallográfiával (AMG) értékelték. Értékelték a kelatizálható cink lokalizációjának különbségeit a magas és alacsony összes cinket tartalmazó mintákban. 25 rövid TTP-vel és 25 hosszú TTP-vel rendelkező pár spermamintáit hagyományos spermaanalízisnek, CASA-nak, induktív csatolású plazma tömegspektrometriás cink- és magnéziummérésnek, valamint láng atomabszorpciós spektrometriás kalciummérésnek vetették alá. A kationok erősen korreláltak egymással, de nem találtak korrelációt a TTP-vel vagy a hagyományos spermaparaméterekkel. A magas cinkkoncentrációjú spermaminták statisztikailag szignifikánsan rosszabb motilitást mutattak a CASA egyenes vonalú sebesség és linearitás paraméterei alapján értékelve, mint az alacsony cinktartalmú minták. A kalciumkoncentráció ugyanezen paraméterek tekintetében szintén statisztikailag szignifikáns különbséget mutatott, de a cinkkoncentráció többszörös regressziós modellbe történő bevitelével a hatás megszűnt. A magas összcink-tartalmú spermaminták az AMG-nél erősebb elszíneződést mutattak az ondóplazmában. Feltételezhető, hogy a magas spermium cinkkoncentráció elnyomó hatással van a spermiumok progresszív motilitására (`mozgás minősége’), de nem a mozgékony spermiumok százalékos arányára (`mozgás mennyisége’).

Bevezetés

Az emlősök spermájának teljes cinktartalma magas, és a cinket a spermatogenezis szempontjából kritikusnak találták. A cinkhiány emberben hipogonadizmussal és a másodlagos nemi jellegek elégtelen fejlődésével jár (Prasad, 1991), patkányban pedig a szemcsetubulusok sorvadását és ezáltal a spermatogenezis elmaradását okozhatja (Millar et al., 1958; Underwood, 1977; Endre et al., 1990). A magas cinkkoncentrációról beszámoltak, hogy csökkenti a spermiumok oxigénfelvételét (Huacuja et al., 1973; Foresta et al., 1990) és az albumin által kiváltott akroszómareakciót (Foresta et al., 1990). A fej-farok rögzülést/leválást és a nukleáris kromatin kondenzációt/dekondenzációt szintén befolyásolja a spermium cinkje (Kvist, 1980; Bjorndahl és Kvist, 1982). A szeminális cink spermiumok motilitására gyakorolt hatásáról ellentmondásos jelentések születtek (Stankovic és Mikac-Devic, 1976; Danscher és mtsai., 1978; Caldamone és mtsai., 1979; Lewis-Jones és mtsai., 1996). Kimutatták, hogy a cinkionok kelátképzése befolyásolja a spermiumok motilitását (Saito és mtsai., 1967; Danscher és Rebbe, 1974), és azt javasolták, hogy a cink spermiumok működésére gyakorolt hatását nem a teljes szeminális cinknek, hanem a hólyagos nagy molekulatömegű fehérjékhez kötött biohasznos cinknek kellene mérnie (Bjorndahl és mtsai., 1991; Carpino és mtsai., 1998).

Ez a tanulmány elsősorban a cinkre összpontosít. Egészséges pároknál vizsgálták az ondó cink, és bizonyos mértékig a magnézium és a kalcium összefüggését a teherbeesésig eltelt idővel (TTP). Továbbá értékelték e kétértékű kationok és a hagyományos spermaparaméterek, valamint a számítógéppel segített spermaanalízis (CASA) paraméterei közötti összefüggést.

Az AMGZn (automometallográfia) egy szövettani módszer a cinkionok és a lazán kötött cinkionok (kelatizálható cink) kimutatására a szövetekben. A cinkionok lokalizációjának különbségeit vizsgálták fénymikroszkópos és elektronmikroszkópos szinten a magas és alacsony összcink-tartalmú férfiak spermiumaiban és ondóplazmájában.

Anyagok és módszerek

Vizsgálati populáció

A négy szakszervezet 52 255 tagja közül összesen 430 párt toboroztak. A 430 párból spermamintát nyertek, a motilitást kézzel és CASA-val (lásd később) értékelték, és a mintákat a további elemzésig fagyasztva (-20°C-on) tárolták. A korábbi reproduktív tapasztalattal nem rendelkező párokat akkor vették fel, amikor abbahagyták a fogamzásgátlást, és legalább hat teljes menstruációs cikluson keresztül vagy a terhesség felismeréséig követték őket . A 430 pár közül 50 teherbe esett párt választottak ki a jelen vizsgálathoz: a legrövidebb TTP-vel rendelkező 25 párt (S-TTP, medián 1 hónap, tartomány 1-2 hónap) és a leghosszabb TTP-vel rendelkező 25 párt (L-TTP, medián 10 hónap, tartomány 7-28 hónap). Ezen 50 pár spermamintáit az alábbiakban említett elemzéseknek vetették alá.

Hagyományos spermajellemzők

A spermamintákat maszturbációval nyerték 50 ml-es steril polisztirol edényekbe, az ajánlott 3 napos absztinencia után. A minták cseppfolyósítás után szobahőmérsékleten az Egészségügyi Világszervezet (1992) kritériumai szerint kerültek elemzésre.

A térfogatot 10 ml-es Falcon mérőüvegcsőben mértük (0,1 ml pontossággal). A spermiumok mozgékonyságának manuális értékelését Makler számláló kamrában (Sefi Medical Instruments, Haifa, Izrael) végeztük. Minden egyes spermiumot a következőképpen osztályoztunk: a: gyors progresszív motilitás, b: lassú vagy lassú progresszív motilitás, c: nem progresszív motilitás, d: immotilitás. Legalább 2×100 pontozást végeztek. Ha két egymást követő számlálás közötti különbség meghaladta a 10%-ot, két új számlálást végeztek. A mozgékony spermiumok százalékos arányát az “a + b + c” csoportokban határoztuk meg. A koncentrációt Makler számláló kamrában mértük, és a morfológiát a Kruger és munkatársai (1986) által leírt Tygerberg-féle “szigorú” kritériumok szerint osztályoztuk levegőn szárított, etanolban és éterben rögzített keneteken, amelyeket Papanicolaou-technikával festettünk (World Health Organization, 1992). A morfológia pontozását egyetlen képzett laboratóriumi technikus végezte. A spermiumok életképességét eozin-negrozin festett keneteken határozták meg.

Computerrel segített spermaelemzés

A CASA anyagát a következőképpen szerezték be: 4,5 μl friss, jól összekevert spermiumot pipettával egy 10 μm mélységű Makler számláló kamrába helyeztünk. A mintát egy Olympus BH-2 fáziskontrasztmikroszkópba (Olympus Denmark A/S, Glostrup, Dánia) helyeztük egy fűtőlemezzel (37°C) ×200-as nagyításon. Egy Sony DXC-107 videokamera (Sony Corp., Tokió, Japán) továbbította a képeket egy Sony PVM-1440QM színes videomonitorra (Sony Corp., Tokió, Japán). A képek rögzítése JVC HR-D560EG/E videokazettás magnóval (JVC Victor Company of Japan, Tokió, Japán) történt. A felvételeket később egy Hobson Sperm Tracker (Hobson Tracking Systems Ltd, Sheffield, Egyesült Királyság) segítségével elemeztük, 25 Hz felvételi frekvenciával, 2 s követési idővel (összesen 50 képkocka), 300×300 μm látómezővel (amely lehetővé tette az összes egyenes vonalú sebességérték kimutatását 150 μm/s-ig). Mintánként 100 spermiumot elemeztek.

Az elemzésekből a következő paramétereket vezették le: görbületi sebesség (VCL), egyenes vonalú sebesség (VSL), linearitás (LIN), átlagos útsebesség (VAP) és az oldalsó fej elmozdulás amplitúdója (ALH).

Cink, magnézium és kalcium meghatározása a spermában

A sperma cinkjét, magnéziumát és kalciumát mind az 50 mintában megmérték. A sperma cink- és magnéziumkoncentrációját induktív csatolású plazma tömegspektrometriával (ICP-MS) határoztuk meg. A műszer a Fisons Elemental (Winsford, Cheshire, Egyesült Királyság) PQ2+ készüléke volt. Egy 20 μl-es aliquotát 100-szorosára hígítottunk egy olyan oldattal, amely 5 g/l 25%-os ammóniát (ARISTAR; Merck, Poole, Egyesült Királyság), 0,5 g/l EDTA-t (Janssen Chimica, Geel, Belgium) és 0,5 g/l Triton X-100-at (Sigma, St Louis, MO, USA) tartalmazott 18 MW-os Millipore vízben. Belső standardként szkandiumot (AccuStandard, New Haven, CT, USA) adtunk 100 μg/l végső koncentrációban. Minden mintát két példányban készítettünk. A kalibrálást vakmintákkal végeztük, amelyekhez cinket és magnéziumot (AccuStandard) adtunk 1, 2 és 3 mg/l végső koncentrációban, ami megfelel az eredeti spermaminták 100, 200 és 300 mg/l-es koncentrációjának. Ezt az analízist csúcsugrásos üzemmódban végeztük 24Mg, 66Zn és 45Sc mérésekkel.

A kalcium meghatározását ugyanezekben a készítményekben láng atomabszorpciós spektrometriával (FAAS) végeztük. A műszer egy Perkin-Elmer 306 (Norwalk, CT, USA) volt. A kalibrálást az eredeti spermaminták 100, 200 és 400 mg/l koncentrációjának megfelelő koncentrációkra végeztük el. A magas kalciumkoncentrációjú mintákat háromszorosára hígítottuk, hogy a kalibrációs görbébe essenek.

A kimutatási határértékek, amelyeket a mintákkal azonos alkalommal készített 10 vakminta standard eltérésének háromszorosaként számoltunk, cink esetében 1 mg/l, magnézium esetében 3 mg/l, kalcium esetében pedig 2 mg/l voltak (a hígítatlan spermaminták koncentrációjában kifejezve). A meghatározások általános szórási együtthatója a duplikált elemzések eredményei alapján kiszámítva a cink esetében 18%, a magnézium esetében 32% és a kalcium esetében 17% volt.

Tíz mintából a cink láng atomabszorpciós spektrometriás (FAAS) meghatározására is készültek preparátumok. Az ICP-MS és a FAAS eredmények lineáris regresszióelemzése 0,79-es meredekséget (95%-os konfidenciaintervallum: 0,58-1,00), 13 μg/l-es metszéspontot és 0,90-es r2-t eredményezett. Az ICP-MS elemzések valamivel magasabb eredményei tehát statisztikailag nem voltak szignifikánsak.

Autometallográfiás (AMG) spermaminták fejlesztése fénymikroszkópos elemzéshez

Öt ICP-MS-sel meghatározott magas (242-308 mg/l) és 5 alacsony (38-57 mg/l) cinktartalmú mintát 0,5%-os nátrium-szulfidban (Bie & Berntsen) inkubáltunk 30 percig, hogy cink-szulfid rácsokat hozzunk létre. Az ejakulátum/szulfid oldatból Farmer kiöblített üveglemezekre keneteket készítettünk. A keneteket levegőn szárítottuk, majd 3%-os glutaraldehidben (Bie & Berntsen) 30 percig fixáltuk, majd 3×2 percre 0,1 M foszfát pufferbe és egyszer 2 percre desztillált vízbe helyeztük.

A keneteket ezután AMG fejlesztéssel a cink-szulfid rácsok ezüst amplifikálásához. A fejlesztőszer 60 ml szűrt gumiarábikum-oldatból (1 kg 2 l desztillált vízben feloldva; Bidinger A/S, Aarhus, Dánia), 10 ml nátrium-citrát pufferből és 0,85 g hidrokinonból (Merck, Darmstadt, Németország) állt, 15 ml meleg, desztillált vízben feloldva. Közvetlenül a felhasználás előtt 0,11 g ezüstlaktátot (Fluka, Buchs, Svájc) adtunk hozzá 15 ml desztillált vízben, és az oldatot alaposan összekevertük.

A sperma keneteket tartalmazó, kiöblített üvegeket 26 °C-os vízfürdőbe helyeztük, majd fényzáró dobozba helyeztük. Az újonnan elkészített AMG-fejlesztőt az üvegekbe öntöttük, és a keneteket 30 percig fejlesztettük a sötét dobozban.

A fejlesztést követően a keneteket 10 percig folyó ionmentesített vízben öblítettük, 5 percig 5%-os nátrium-tioszulfátba helyeztük, 2 percig folyó ionmentesített vízzel mostuk, 30 percig 70%-os etanollal utófixáltuk, és végül 2 percig folyó ionmentesített vízzel mostuk. Az ellenfestést 0,1%-os vizes toluidinkék oldattal végeztük, pH 4,0 (1 g toluidinkék 1000 ml pufferben): 614,5 ml 0,1 M citromsav-monohidrát és 385,5 ml 0,2 M dinátrium-hidrogén-foszfát-dihidrát; Merck, Darmstadt, Németország). A keneteket 2 × 2 percre desztillált vízbe, 3 × 3 percre 99%-os etanolba, 3 × 3 percre xilolba helyeztük, végül DEPEX-szel (Merck, Darmstadt, Németország) rögzítettük.

A spermaminták előkészítése elektronmikroszkópos elemzéshez

A spermaminták keneteit a fent leírtak szerint készítettük, kivéve, hogy nem rögzítettük DEPEX-szel. Az eljárást követően 0,5%-os ozmiumtetroxidot adtunk hozzá 30 percre, majd a keneteket 3×2 percre pufferbe és 1×2 percre desztillált vízbe helyeztük. Az ozmium-kontrasztos keneteket fénymikroszkópban tanulmányoztuk, és a további elektronmikroszkópos elemzésekhez szükséges területeket gyémántkéssel jelöltük meg.

A kiválasztott keneteket fokozatos etanololdatokban dehidratáltuk, és Eponba (Bie & Berntsen) ágyaztuk. Az előzőleg megjelölt, érdekes területekre helyezett Epon blokkokat 24 órán keresztül 60°C-on tartottuk, majd letörtük az üvegkeneteket. Félvékony (3 μm) metszeteket vágtunk és üveglemezekre helyeztük. A fénymikroszkópos elemzések után a kiválasztott metszeteket újra Eponba ágyaztuk, majd ultravékony metszeteket készítettünk, és ólom-citráttal ellenfestettük, mielőtt JEOL 100S elektronmikroszkópban megvizsgáltuk volna.

Statisztikai módszerek

Az adatokon többszörös regressziós elemzést alkalmaztunk, hogy kimutassuk az egyes paraméterek hatását az eredményre. Spearman-féle rangkorrelációs együtthatókat számoltunk több korrelációra. A csoportok összehasonlítására a Wilcoxon rangösszeg-tesztet végeztük a mediánok különbségére.

Eredmények

Az I. táblázatban a cink-, magnézium- és kalciumtartalom, valamint a kationok relatív aránya az ondóplazmában szerepel. E paraméterek mediánjainak összehasonlítása a két csoportban S-TTP versus L-TTP kétmintás t-próbával nem mutatott statisztikailag szignifikáns különbséget egyik paraméter esetében sem. Erős pozitív interkorrelációt találtunk a cink, a magnézium és a kalcium között (a Spearman-féle rangkorrelációs együtthatók 0,79-0,86, P < 0,01) (1. ábra).

Egyik kation sem korrelált szorosan a hagyományos sperma paraméterek bármelyikével. Amikor többszörös regressziós elemzést végeztünk az összes adaton, csak a cinktartalom jött ki 0,05 alatti P-értékkel a következő CASA paraméterek esetében: VSL 0,04 és LIN 0,008. Sem a magnézium, sem a kalcium bevitele a modellbe nem javított az értékeken.

A spermamintákat két azonos méretű csoportra osztottuk az egyes kationok kationállapota szerint. A következő elválasztó pontokat határoztuk meg (az összes 50 minta mediánja): cink 112 mg/l, magnézium 98 mg/l és kalcium 476 mg/l. A két csoport között számos statisztikailag szignifikáns különbséget észleltünk (II. táblázat). A P-értékek a cinkcsoportoknál jelezték a legnagyobb különbségeket, a kalciumcsoportoknál közepes különbségeket, a magnéziumcsoportoknál pedig csak gyenge különbséget mutattak (a LIN kivételével).

A kationok közötti relatív arányra vonatkozóan (III. táblázat) az osztópontok a következők voltak: cink:magnézium 1,26, cink:kalcium 0,22. A 0,22 feletti cink:kalcium arányú minták statisztikailag szignifikánsan alacsonyabb értékeket mutattak a VSL, LIN és STR CASA paraméterek tekintetében, mint a 0,22 alatti arányú minták. A cink:magnézium korreláció 0,86 (Spearman-féle rangkorrelációs együttható), a cink:kalcium korreláció pedig 0,79. Úgy tűnik, hogy a cink-tartalom szorosabb kapcsolatban áll a magnézium-, mint a kalciumtartalommal, ami magyarázatot adhat a csoportok közötti különbségre.

Az AMG-készítmények cinkion-tartalmának értékelésekor fénymikroszkópos szinten különbséget észleltek az alacsony összes cinket tartalmazó mintákban a magas összes cinket tartalmazó mintákhoz képest. A 2. ábra az AMG-festés különbségeit mutatja egy 299 mg/l és egy 53 mg/l szeminális cinket tartalmazó minta esetében. Az alacsony összes cinket tartalmazó mintákban az akroszóma, a farok és az ondóplazma körüli festődés ritkának bizonyult. Ezeket a megállapításokat elektronmikroszkópos szinten nem lehetett megerősíteni (3A. ábra), és különösen a spermiumok intracelluláris festődésében nem volt különbség. A 3B. és 4. ábra a cinkionok lokalizációját mutatja a spermiumok farkában. Az egész farokban megtalálható, koncentráltan a flagelláris járulékos rostokban és a membránban. Az ondóplazmában a mikrométeres méretű testek cinkion-tartalomban gazdagnak bizonyultak (5. ábra).

Edöntés

Ez a legjobb tudomásunk szerint az első olyan tanulmány, amely az ondóplazma cink, magnézium és kalcium TTP és CASA paraméterekre gyakorolt hatását értékeli egészséges emberekben. Összefüggést találtunk a magas cinkkoncentráció és a spermiummozgások alacsony linearitása között, ami a VAP, VSL, STR és LIN csökkenésében nyilvánult meg. A magnézium- és kalciumkoncentráció szorosan korrelált a cinkkoncentrációval, de nem állt olyan szoros kapcsolatban a CASA paraméterekkel. A mozgóképes koncentrációt nem befolyásolta a cink, a magnézium és a kalcium teljes koncentrációja. Ugyanakkor különbségeket találtak a magas és az alacsony cinktartalom és néhány CASA paraméter között (II. táblázat). A legalacsonyabb összes cinket (72 mg/l medián) tartalmazó 25 ondóminta és a legmagasabb összes ondócinket (187 mg/l medián) tartalmazó 25 minta összehasonlításakor a Wilcoxon rank-sum teszt a VSL (P = 0,004), valamint a LIN (P = 0,001) mediánjai között statisztikailag szignifikáns különbséget mutatott. A VAP esetében a különbség szintén szignifikáns volt (P = 0,02). A VCL esetében nem találtak különbséget. Mivel az alacsony és magas cinktartalmú mintákban nem volt különbség a százalékos motilis vagy a motilis koncentrációban, ezért úgy tűnik, hogy a cinkben gazdag környezetben a spermiumok véletlenszerűbben és kevésbé előrehaladó módon mozognak. Úgy tűnik, hogy nem csökkenti a mozgékony spermiumok számát.

A VSL azt fejezi ki, hogy a spermiumsejt egy bizonyos idő alatt mennyire mozog egyenesen előre, és klinikai szempontból valószínűleg ez a legfontosabb CASA paraméter. Moore és Akhondi (1996) epididymális patkányspermiumok megtermékenyítő képességét vizsgáló tanulmánya kimutatta, hogy a VSL csökkenése erősen negatívan korrelál az in vitro megtermékenyítés eredményével.

Az évek során sok vita folyt a spermiumplazma cinkjének a spermiumok működésére gyakorolt szerepéről. A spermiumfejben sokszor nagyobb koncentráció halmozódik fel, mint a spermiumplazmában, és a cink nélkülözhetetlen a kromatin stabilitásához és ahhoz, hogy a kromatin a megfelelő időben dekondenzálódjon (Kvist, 1982; Kvist és Bjorndahl, 1985; Kvist és mtsai., 1987, 1988), és a cink fiziológiai szerepét a fej-farok leválás inherens mechanizmusának megőrzőjeként feltételezték (Bjorndahl és Kvist, 1982). A spermiumok cinkjének a spermiumok motilitására gyakorolt hatásáról azonban ellentmondásos jelentések születtek, és a legtöbb tanulmány mennyiségi értékelésekkel foglalkozott. Lewis-Jones és munkatársai (1996) vizsgálatában 1178 termékenységi kezelésre beutalt betegnél mérték a spermiumplazma cink- és fruktózkoncentrációját, de a cink esetében nem találtak statisztikailag szignifikáns összefüggést a motilitással. Abou-Shakra és munkatársai (1989) ICP-MS segítségével számos nyomelemet mértek az ondóplazmában, de nem találtak összefüggést az ondó cinkkoncentrációja és a spermasűrűség vagy a mozgékonyság között normospermiás, oligospermiás vagy azoospermiás férfiaknál. Az ő vizsgálatukban a cink koncentrációja hasonló volt az ebben a tanulmányban bemutatott szintekhez. Danscher és munkatársai (1978) arról számoltak be, hogy a magas cinkkoncentráció összefüggésbe hozható a spermiumok csökkent motilitásával, míg mások a spermiumplazma magas cinktartalmát a spermiumok nagyfokú motilitásával hozták összefüggésbe (Stankovic és Mikac-Devic, 1976; Caldamone és munkatársai, 1979).

Ebben a tanulmányban mind az összes cink mennyiségi értékelésével, mind a cinkionok lokalizációjának minőségi meghatározásával foglalkoztunk a spermiumsejtben és az ondófolyadékban. Bár a spermiumok cinkion-tartalmában ultrastrukturális szinten (2A ábra) nem észleltünk különbséget a magas vagy alacsony összes cinket tartalmazó minták között, a fénymikroszkópos szinten (1. ábra) észlelt jellemzők tükrözhetik a cink teljes mennyisége és az ondóplazma szabad cinkionjai közötti összefüggést. Újabb tanulmányokban Lewis-Jones és munkatársai (1996), valamint Carpino és munkatársai (1998) arra a következtetésre jutottak, hogy az összes szeminális cink a spermatogén aktivitás megbízhatatlan markere, és a hólyagos, nagy molekulatömegű fehérjékhez kötött biológiailag hozzáférhető cinkionokat javasolják jobb indexnek. Az itt bemutatott AMG-módszer a kelatizálható cinket, azaz a plazmában lévő cinkionokat vagy a makromolekulákhoz lazán kötött cinket mutatja ki. A fehérjékhez szilárdan kötött cinket az AMG nem fogja kimutatni, és az nem kelatizálható. Egyetértünk az említett tanulmányokkal abban, hogy a biológiailag hozzáférhető (tehát kelatizálható) cink az, amely a spermiumsejtekre, többek között a motilitásra is hat. Ez a vizsgálat azt jelzi, hogy az összes cink és a kelatizálható cink koncentrációja összefügg. További vizsgálatokra van szükség, és a számítógépes képelemzés pl. AMG-készítményekről fontos eszköz lehet.

A cink hatásával ellentétben a magas magnéziumkoncentráció önmagában nem tűnt gátló hatásúnak a spermiumok motilitására. A LIN-re negatív hatást találtak, de ez nem volt elég nagy ahhoz, hogy hatással legyen a többi CASA paraméterre. Arról számoltak be, hogy az emberi ondóplazma prosztata eredetű szekréciós granulumokat és vezikulákat tartalmaz, amelyek a környezetükben lévő esszenciális kationok koncentrációjának modulálásával szabályozó hatást gyakorolhatnak a spermiumok motilitására (Stegmayr és mtsai., 1982). Ezen organellumok membránjai Mg2+- és Ca2+-függő ATPázt tartalmaznak, amelyet a Zn2+ kompetitíven gátol (Ronquist és mtsai., 1978a,b). Korábban magas pozitív korrelációról számoltak be a cink és a magnézium között az ondóplazmában (Papadimas et al., 1983; Umeyama et al., 1986), és ebben a vizsgálatban is hasonlóan erős korrelációt találtak mindhárom kation között (r = 0,79-0,86, P < 0,01).

A kalcium fontos a spermium fiziológiájában, beleértve a motilitást is (Morton et al., 1974; Lindemann et al., 1987), az anyagcserében (Peterson és Freund, 1976), az akroszómareakcióban és a megtermékenyítésben (Yanagimachi és Usui, 1974; Yanagimachi, 1981). A spermium kalciumnak a spermiumok mozgékonyságában betöltött szerepe azonban nem teljesen tisztázott. Thomas és Meizel (1988) úgy találta, hogy az extracelluláris kalciumionok EGTA-val történő kelátozása gátolja az akroszómareakciót, ugyanakkor nincs hatással a motilitásra. Az akroszómareakciót indukáló kétértékű kationionofór ionomicin hozzáadása szintén nem volt hatással a motilitásra, de jelentősen növelte az akroszómareakciót végző spermiumok számát. Magnus és munkatársai (1990) nem találtak összefüggést az ionizált kalcium koncentrációja és a progresszív mozgást mutató spermiumok aránya között. Arver és Sjöberg (1982) arról számolt be, hogy az alacsony ionizált kalciumtartalom több és jobban progresszívan mozgó spermiummal jár együtt. Prien és munkatársai (1990) összehasonlították a spermiumok motilitását, sebességét és progresszív mozgását a teljes és ionizált kalciummal normál (>60%) és csökkent (<60%) spermiummotilitású betegeknél. Az összkalciumban nem találtak különbséget, de statisztikailag szignifikáns csökkenést találtak az ondó ionizált kalciumában azoknál a férfiaknál, akiknek csökkent volt a motilitása. Ebben a vizsgálatban az összkalciumot mértük, de az ondóplazma kalciumkötő kapacitása nem ismert. A kalciumhoz hasonlóan nem mutattak ki hatást a motilitás koncentrációjára, és a CASA paraméterekkel való korrelációk gyengébbek voltak, mint a cink esetében (II. táblázat). Mind a VSL, mind a LIN fordítottan szignifikáns korrelációt mutatott a teljes kalciumkoncentrációval (P = 0,02 mindkettő esetében), míg a VCL-re nem volt hatással. A cinkkoncentráció hozzáadása a többszörös regressziós elemzéshez azonban megszüntette a teljes kalciumkoncentrációnak a motilitásra gyakorolt hatását. Ez összhangban van Prien és munkatársai (1990) korábban említett tanulmányával. Ebben a vizsgálatban az alacsony cink:kalcium arányú minták statisztikailag szignifikánsan jobb CASA értékeket mutattak (VSL, LIN és STR) a magas arányúakhoz képest. Ez elsősorban a cinkkoncentrációban mutatkozó különbségeknek köszönhető.

A cink, magnézium és kalcium meghatározás pontossága ebben a vizsgálatban viszonylag gyenge volt, a variációs együtthatók 18, 32 és 17%-osak voltak. Ennek oka valószínűleg a minták inhomogenitása, ami a kis mintatérfogattal (20 μl) kombinálva ronthatta a pontosságot. A nagyfokú pontatlanság ellenére a cink és magnézium meghatározások során keletkezett szórás a minták nagy koncentrációtartományához képest csekély volt.

Már korábban kimutatták, hogy a cinkionok kelátképzése befolyásolja a spermiumok mozgékonyságát emberben (Danscher és Rebbe, 1974), patkányban és kutyában (Saito és mtsai., 1967; Stoltenberg és mtsai., 1997). Jelenleg folynak a cinkionok intra- és extracelluláris kelátképzésével kapcsolatos vizsgálatok, amelyekből kiderülhet a cinkionok elhelyezkedésének jelentősége az ondófolyadékban és a spermiumsejtben.