Az eljárás általános célja az RNS és a DNS szekvenciális kivonása archivált, formalinban fixált, paraffinba ágyazott szövetmagokból. Ez a protokoll olyan szövetmagok gyűjtésére szolgál, amelyekből mind az RNS-t, mind a DNS-t kivonjuk. Ennek a protokollnak a fő előnye, hogy javítja az RNS- és DNS-hozamot a szövettömb pontosan megcélzott régióiból.

Ezt az eljárást nagyrészt archív prosztatarákos szöveteken fejlesztették ki. Más típusú archív szövetekre is alkalmazható. Ennek a módszernek a vizuális bemutatása kritikus fontosságú, mivel a szövetek kimetszésének lépéseit a kutatólaboratóriumokban általában nem alkalmazzák.

A legtöbb kutatólaboratórium ehelyett keresztmetszeteket használ, ami gyorsabban kimeríti a szöveteket, és jelentős heterogenitást ad a mintához. Kezdje a mikroszkópos tárgylemez áttekintésével és az érdeklődésre számot tartó régió körvonalazásával egy finom hegyű tartós filctollal. Ezután vágjon ki egy elég nagy paraffinfólia-szakaszt ahhoz, hogy a mikroszkópos tárgylemezen lévő érdekes régiót lefedje.

Ezután helyezze a fóliát szilárdan a tárgylemezre, és tekerje be a fóliát a széleken, hogy ne csússzon el. Egy finom hegyű tartós filctollal körvonalazzuk a teljes szövetet és a szöveten belül az érdeklődésre számot tartó régiót. Ezután távolítsa el a fóliát a tárgylemezről, és helyezze át a megfelelő szövetblokkba.

A fóliát megfordítva vagy elforgatva igazítsa ki úgy, hogy a teljes szövet körvonala megegyezzen a blokkban lévő szövet megfigyelt alakjával. Az elcsúszás megakadályozása érdekében szorosan nyomja a fóliarészletet a blokk felületéhez. A tartós filctoll hegyével készítsen sekély, de látható bemélyedéseket a vizsgált régió körvonala mentén, majd távolítsa el a filmet.

A következő lépésben tisztítsa meg a 0,6 milliméteres lyukasztó készlet receptorlyukasztóját úgy, hogy a hegyet egy milliliter fehérítőt tartalmazó 1,5 milliliteres mikrocentrifugacsőbe meríti, és a lyukasztót többször fel-le csúsztatja. Ismételje meg a mosást a 70 százalékos etanolt tartalmazó csővel, majd vízzel. Most nyomja be a megtisztított lyukasztót a kívánt régióba három milliméter mélységig, majd húzza vissza.

A magot a lyukasztóból a stift segítségével kinyomva engedje ki egy alacsony kötésű mikrocentrifugacsőbe. Adjunk egy milliliter xilolt a szövetmagokat tartalmazó mikrofúziós csövekhez, és tíz másodpercig erőteljesen vortexeljük. Ezután helyezze három percre 50 Celsius-fokra állított hőblokkba.

Az inkubációt követően két percig centrifugáljon szobahőmérsékleten, maximális fordulatszámon. A centrifugálás után helyezze a magokat öt percre jégre, hogy a viaszos maradék megszilárduljon. Most óvatosan távolítsa el a meniszkusz körül felgyülemlett paraffint a felülúszóval együtt egy pipettahegy segítségével.

Ezután ismételje meg a xilolos kezelést. A paraffin-xilol keverék eltávolítása után adjon hozzá egy milliliter 100 százalékos etanolt, és tíz másodpercig erőteljesen vortexeljen. Miután két percig maximális sebességgel centrifugáltunk, óvatosan dobjuk el az etanolt.

Ismételjük meg még egyszer az etanolos mosást, mielőtt elkezdenénk a homogenizálást. A homogenizálás előtt reszuszpendálja a deparaffinált magokat 700 mikroliter 100 százalékos etanolban. Használjon motoros szövethomogenizálót közepes fokozaton, hogy a magokat finom részecskékké őrölje.

A szövetmagok alapos homogenizálására van szükség az optimális DNS- és RNS-hozamhoz. Ezután töltsön külön 15 milliliteres csövekbe körülbelül tíz milliliter fehérítőt, RNáz semlegesítő oldatot és 70 százalékos etanolt. A minta homogenizálása után a homogenizáló szondát a tisztítóoldatok mindegyikében sorrendben mossa át.

A mosási szakasz alatt a homogenizálót a legmagasabb fordulatszámon futtassa. Törölje le a szondát egy zsebkendővel, és hagyja teljesen megszáradni a szondát a következő minta homogenizálása előtt. Vizuálisan ellenőrizze a szonda pengéit a visszamaradt szövetdarabok szempontjából, és ha talál, tisztítsa meg újra a szondát.

A homogenizálást követően 100 százalékos etanollal állítsa a minta térfogatát egy milliliterre, majd 15 percig centrifugáljon maximális fordulatszámon. Óvatosan szívja le az etanolt, és a proteináz K extrakció megkezdése előtt körülbelül 15-20 percig szárítsa levegőn a pelleteket. Reszuszpendálja a pelleteket 150 mikroliter proteináz K emésztési pufferben, és a pellet fellazításához forgassa meg a csöveket.

A nagyobb DNS-kinyerés érdekében az éjszakai proteináz K emésztés ajánlott. Adjunk hozzá 10 mikroliter hőmérséklet-stabil proteináz K-t, és keverjük össze pöccintéssel. Inkubáljuk 56 Celsius-fokon 15 percig enyhe keverés mellett.

Három percig inkubáljuk a csöveket jégen. Hűtés után centrifugálja a csövet 15 percig maximális fordulatszámon. Ezután a pelletek megzavarása nélkül óvatosan helyezze át az egyes felülúszókat egy új mikrocentrifugacsőbe az RNS-tisztításhoz.

Az RNS-t és a DNS-t az írott protokollban szereplő optimalizált eljárás szerint vonja ki, amely a DNS-kivonáshoz meghosszabbított szöveti emésztési időt tartalmaz. RNS és DNS nyerhető ki régebbi, formalinban rögzített, paraffinba ágyazott szövetmintákból ezzel a módszerrel. A nukleinsavakat három és 14 év közötti mintakorú prosztatarákmintákból együtt extrahálták.

Az átlagos hozam 2, 270 nanogramm RNS és 820 nanogramm DNS volt. Érdekes módon nem volt szignifikáns korreláció a szövetminta kora és a nukleinsav-kinyerés között. Összességében az RNS- és DNS-hozamok korreláltak a minták között, bár a legtöbb esetben több mint kétszer annyi RNS-t nyertek vissza a DNS-hez képest.

Az ezzel a protokollal kivont genomiális DNS teljesítményének bizonyítására archív prosztatarákmintákból származó biszulfit-konvertált DNS-kivonatokat metiláció-specifikus PCR-rel amplifikáltak. Az ALU ismétlődő elemeket metilációs kontrollként használták, és a minták között kevés eltérést mutattak. A GSTP1, egy olyan gén, amelyről ismert, hogy prosztatarákban hipermetilált, nem mutatott kimutatható amplifikációt metilációs specifikus PCR-rel, amikor jóindulatú mintákból kivont DNS-t használtak.

Agresszív prosztatarákban szenvedő betegekből származó DNS-minták kimutatható QPCR-ciklusküszöbértékeket mutattak, amelyek alacsonyabbak voltak, mint az indolens prosztataráksejtekből származó értékek, ami a GSTP1 fokozott metilációjára utal az agresszív prosztatarákban. Ha ezt a technikát egyszer elsajátítottuk, RNS esetében három-négy óra alatt, DNS esetében pedig az éjszakai emésztést követően négy óra alatt elvégezhető, ha megfelelően végezzük. Ez a technika lehetővé tenné a molekuláris patológia kutatói számára, hogy diagnosztikus DNS- és RNS-biomarkereket vizsgáljanak a különböző rákos megbetegedésekben.

A videó megtekintése után jól meg kell értenie, hogyan kell előkészíteni a szövetmagokat a DNS és RNS kivonásához az archív szövetblokkok pontosan feltérképezett, érdekes területeiről.