Az 1960-as években két mérföldkövet értek el a bélrendszeri cukorfelszívódás fiziológiájában. Az első Crane és munkatársai Na+-glükóz kotranszport hipotézise volt (1), amely magyarázatot adott az aktív cukortranszportra, a második pedig a glükóz- és galaktóz malabszorpció (GGM) felfedezése volt a betegeknél (5, 6). A kotranszport-hipotézist kimerítően tesztelték, megerősítették és kiterjesztették a legkülönbözőbb szubsztrátok sejtekbe történő “aktív transzportjára”, az Escherichia coli laktózakkumulációjától kezdve a pajzsmirigyben történő jodidakkumulációig. Lényegében a kotranszporterek olyan molekuláris gépek, amelyek a sejtmembránokon keresztül a Na+ vagy H+ ionok elektrokémiai potenciálgrádiensének formájában tárolt energiát használják fel a specifikus oldott anyagok és víz sejtekben való felhalmozódásának irányítására (22). Az intestinális Na+-glükóz kotranszporter (SGLT1) a Na+ és a membránon keresztüli elektromos gradienseket használja arra, hogy a cukrot és a vizet a koncentrációgradiensükkel szemben az enterocitákba vezesse (9, 13, 23). A glükózt és a galaktózt egyaránt az SGLT1 kezeli, míg a fruktózt a saját privát szállítója, a facilitált fruktóztranszporter (GLUT5) szállítja át a kefeszegélyen. A glükóz, galaktóz és fruktóz a bazolaterális membránban lévő másik facilitált cukortranszporteren (GLUT2) keresztül fejezi be útját a sejten keresztül a vérbe (1. ábra).

A GGM-et újszülöttkori kezdetű, vizes és savas, súlyos hasmenés jellemzi, amely néhány héten belül halálos kimenetelű, hacsak a laktózt (glükózt és galaktózt) nem távolítják el az étrendből (2). A hasmenés megszűnik koplalással vagy a káros cukrok étrendből való kivonásával, de a laktózt, glükózt vagy galaktózt tartalmazó táplálék szájon át történő etetése után azonnal újraindul. A fruktóz felszívódása nem változik. A betegség tünetei és a bélrendszeri cukorfelszívódásról akkoriban ismert ismeretek alapján azt jósolták, hogy a GGM a kefe-határ Na+-glükóz kotranszporter hibájából ered. Ezt a hipotézist erősítették meg az első amerikai GGM-beteg nyálkahártya-biopsziáin végzett kiváló autoradiográfiás galaktózfelvételi és florizin-kötési kísérletek (17, 18). Ezek a kísérletek azt mutatták, hogy a galaktóztranszport csökkenése a florizin ecsethatárhoz való kötődésének 90%-os csökkenésével járt együtt. A florizin az SGLT1 specifikus, nem transzportált, kompetitív inhibitora.

A GGM legmegbízhatóbb diagnosztikai tesztje a H2 kilégzési teszt (2. ábra). Glükóz vagy galaktóz (2 g/kg) szájon át történő beadása a GGM-ben szenvedő betegeknél jóval 20 rész/millió fölé emelkedő H2-légzési értéket eredményez, de a kontrolloknál vagy a fruktózzal táplált betegeknél nincs ilyen emelkedés. A GGM-ben szenvedő gyermekek fruktózpótló tápszerekkel “normálisan” fejlődnek, de a tünetek még felnőttkorban is visszatérnek már egy teáskanálnyi glükóz (6 g) mellett is, és a H2 kilégzési teszt pozitív marad. A betegség meglehetősen ritka. Világszerte körülbelül 200 betegről tudunk, és az esetek nagy része vérségi rokonságból származik.

A bélrendszeri cukorfelszívódás fiziológiáját és patofiziológiáját 1987-ben a nyúl Na+-glükóz-kotranszporter klónozásával egy új stratégiával, amelyet “expressziós klónozásnak” neveztünk el, előremozdítottuk. Ezt a sikert hamarosan követte a humán Na+-glükóz kotranszporter klónozása Turk és Hediger által (4), valamint Turk és munkatársai (20) által az első olyan transzporter mutációjának azonosítása, amely genetikai betegséget, GGM-et okoz. Bélbiopsziát szereztünk két testvértől, akiknél GGM-et diagnosztizáltak, valamint vérmintát a szülőktől, akik unokatestvérek. Turk és munkatársai (20) homozigóta, miszense mutációt (Asp28Asn) azonosítottak az SGLT1 cDNS-ben mindkét nővérből, megállapították, hogy mindkét szülő hordozója ennek a mutációnak, és oocita-expressziós próbával kimutatták, hogy a mutáció valóban teljesen megszünteti a Na+-glükóz kotranszportot. Ugyanebben a rokonságban később prenatális szűrést végeztek két magzaton, és az egyiket (a probandus testvérét) az Asp28Asn mutáció hordozójának, a másikat (egy unokatestvérét) pedig normálisnak találták. Mindkét gyermek diétás korlátozás nélkül is jól élt, és legalább két évig tünetmentesek maradtak (11).

A további fejlődést kezdetben akadályozta, hogy nehéz volt nyálkahártya-biopsziás mintákat szerezni GGM-ben szenvedő gyermekektől, mígnem Turk és munkatársai (21) sikeresen feltérképezték a teljes emberi SGLT1-gént. A gén nagyméretű, 15 exonnal, amelyek 72 kb DNS-en oszlanak meg. Miután az exonokat és az azokat kísérő régiókat szekvenálták, kifejlesztettek egy egyszálú konformációs polimorfizmus-tesztet a betegek mutációinak szűrésére kis vérmintából származó genomi DNS felhasználásával. Ez a fejlesztés magában foglalta a 15 exon és intron-exon csomópontjaik PCR-amplifikációját, valamint a denaturált PCR-termékek gélelektroforézisét a mutációkat hordozó exonok azonosítására. Az anomális exonokat ezután szekvenálták. Annak megállapítására, hogy a mutációk felelősek-e a cukortranszport hibájáért, a mutánsokat Xenopus laevis oocitákban Na+-glükózfelvételi próbákhoz expresszáltuk. Martı́n (10., 12. hivatkozás és nem publikált megfigyelések) nagyrészt a projekt ezen szakaszáért volt felelős. A betegséget okozó mutációkat a 34 vizsgált GGM-páciens közül 33-ban azonosították. A betegek 17 fajta esetében homozigóta mutációkat hordoztak, további 10 fajta esetében pedig a betegek összetett heterozigóta mutációkat mutattak. Ezek között 22 miszenzmutáció (lásd a 3. ábrát), valamint 4 splice-site és 3 nonsense mutáció volt, amelyek súlyosan csonka SGLT1-fehérje termelődését eredményezik. Az, hogy a 34. betegnél nem sikerült kimutatni a mutációkat, annak tudható be, hogy a mutáció a gén promóter régiójában volt, és az erről a területről származó DNS-t nem vonták be a szűrési eljárásba.

Transzportfiziológusként azért érdekeltek a GGM miszenzmutációk, mert potenciálisan képesek azonosítani a fehérjében a transzport szempontjából kritikus maradékokat. Ezért nekiláttunk annak meghatározásához, hogy a miszense-mutációk valójában hogyan okozzák a Na+-cukortranszport hibáját. Ebben a megközelítésben, amelyet nagyrészt Lostao végzett (lásd a 10. és 12. hivatkozást), a mutáns fehérjéket X. laevisoocytákban expresszáltuk, majd biofizikai és biokémiai módszerekkel meghatároztuk a fehérje szintjét a sejtben és a plazmamembránban. Azokban az esetekben, amikor a transzporter a plazmamembránba került, a transzportciklus részreakcióit vizsgáltuk (7). Kezdetben csalódottan tapasztaltuk, hogy az első 21 vizsgált miszenzmutáns esetében az elsődleges hiba a transzporterek sejtben való helytelen mozgásának volt köszönhető. A Western blotok alapján az összes mutáns a vad típusú SGLT-hez hasonló vagy annál magasabb szinteken szintetizálódott. A töltésmérések (7) és az oocita plazmamembrán fagyasztásos elektronmikroszkópiája (24) azonban azt mutatta, hogy a cotranszporterek száma a plazmamembránban jelentősen csökkent (10, 12). A mutánsok mag- és komplex glikozilációjának mértéke alapján megítélve az SGLT1 plazmamembránba történő transzportjának hibája vagy az endoplazmatikus retikulum és a Golgi, vagy a Golgi és a plazmamembrán között következett be. A mutáns fehérjék félrecsúszása lehet a transzporter missorting elsődleges oka (19). Csak egy esetben, a Gln457Arg esetében volt a mutáns fehérje az oocita plazmamembránjában a normális szint közelében.

Milyen jelentőséggel bírnak ezek az oocitákon végzett kísérletek a GGM betegek bélrendszerében? Ennek megválaszolására megvizsgáltuk (nem publikált adatok) az SGLT1 fehérje eloszlását immuncitokémiai módszerrel három homozigóta mutációval rendelkező beteg nyálkahártya-biopsziájában. Mindhárom esetben a mutáns fehérjék eloszlása az oocitában megegyezett az SGLT1 eloszlásával a betegek enterocitáiban: kettőnél a fehérje a citoplazmában, egynél pedig a kefeszegélyben volt. Az oocitákon kapott eredményeink és az első amerikai GGM-beteg biopsziáin végzett autoradiográfiás vizsgálatok során kapott eredmények között is van egyezés (18). Stirling és munkatársai (18) azt találták, hogy a betegnél a florizin kötődése a kefehatárhoz 90%-kal csökkent, mi pedig nem találtunk mutáns SGLT1-fehérjét (Cys355Ser és Leu147Arg) az oocita plazmamembránjában (10). Ezek a vizsgálatok arra utalnak, hogy legalábbis e négy GGM mutáns esetében az oocita reprodukálja a mutáns fehérje viselkedését az enterocitában.

A fő fennmaradó kérdés, hogy a fehérjében eloszló miszense mutációk (3. ábra) hogyan zavarják a transzporter plazmamembránba irányuló kereskedelmét. Ennek a kérdésnek a megválaszolása fontos a plazmamembránfehérjék bioszintézisének megértéséhez és a GGM-ben szenvedő gyermekek jobb terápiájának kidolgozásához.

A GGM mutációja az egyik rokonban, a Gln457Arg, felbecsülhetetlen betekintést nyújtott a cukortranszport mechanizmusába. Lostao tanulmányozta (előkészületben) az oocitákban és a beteg bélnyálkahártyájában expresszált Q457R SGLT1 viselkedését, és megállapította, hogy a fehérje transzlálódik, glikozilálódik és beépül a plazmamembránba, de nem képes cukrot szállítani. Cukor hiányában a mutáns fehérje Na+-t szállít a Na+-szivárgási vagy Na+ uniport útvonalon, és ezt florizin blokkolja. A glükóz szintén gátló hatású, mert szintén blokkolja ezt a Na+ transzportutat, ami arra utal, hogy a glükóz kötődik a Q457R SGLT1-hez, de nem transzportálódik, azaz a mutáció cukortranszlokációs hibát eredményez. Panayotova-Heiermann és munkatársai (15) egymástól függetlenül kimutatták, hogy az SGLT1-en keresztüli cukor-“pórust” az SGLT1 Q457 maradékot tartalmazó COOH-terminális doménje képezi.

Ezeket a megfigyeléseket kihasználva megvizsgáltuk a Q457 szerepét a cukortranszlokációban. Ebben a vizsgálatban a Q457C ciszteinmutánsról megállapítottuk, hogy megőrzi teljes Na+-glükóz transzportaktivitását, eltekintve a látszólagos glükóz Michaelis-Menten konstans (Km) 0,4 mM-ról 6 mM-ra történő növekedésétől, és a Q457C kémiai mutagenezise töltött vagy semleges alkiláló reagensekkel (metanetilszulfonátok, MTS) a cukortranszport teljes blokkolását eredményezte. Mivel azonban az alkilezett Q457C fehérje a glükózt a Q457C SGLT1 cukortranszportjának látszólagos Km értékéhez nagyon hasonló disszociációs állandóval köti, ez a maradék nem lehet a cukorkötőhely része. A Q457C általi cukortranszport MTS általi gátlása csak akkor következett be, amikor a kotranszporter a kifelé néző Na+ konformációban, C2-ben volt (4. ábra). A reagens nem volt hatásos Na+ hiányában, Na+ és glükóz (vagy florizin) jelenlétében, illetve Na+ jelenlétében depolarizált membránpotenciálon. A rhodamin-jelölt Q457C-vel végzett feszültségugrásos kísérletek azt is kimutatták, hogy a fluoreszcencia időbeli lefolyása és szintje szorosan követte a kotranszporter C2 és C6 konformációk közötti átmenetét (4. ábra). Ezeket az eredményeket úgy értelmezzük, hogy a kotranszporter legalább három különböző konformációban (C6, C2 és C3) létezhet, és hogy a Na+ és a cukortranszport közötti csatolás a fehérje ligandum és feszültség által kiváltott konformációs változásain keresztül történik.

Az SGLT1 COOH-terminális doménjében lévő két másik GGM miszenzmutációval, az A468V és az R499H (3. ábra) végzett előzetes vizsgálatok azt mutatják, hogy a maradékok ciszteinnel való helyettesítése helyreállítja a fehérje forgalmát a petesejt plazmamembránjába. Mindkét fehérje funkcionális, és a cukortranszportot MTS-reagensek blokkolják. A Q457C-hoz hasonlóan ezek a maradékok csak akkor hozzáférhetőek az MTS-reagensek számára, ha a fehérjék C2-konformációban vannak. Ezek az eredmények alátámasztják azt a nézetemet, hogy a 10-13 transzmembrán hélixek (3. ábra) alkotják a cukorpórust. További munkára van szükség a Na+ pórus azonosításához.

Összefoglalva, az SGLT1 molekuláris biológiai vizsgálatai a humán SGLT1 cDNS klónozásához és a gén feltérképezéséhez vezettek, ami hatékony új eszközöket biztosított a Na+-glükóz kotranszport fiziológiájának vizsgálatához és a GGM tanulmányozásához. Megerősítést nyert, hogy a GGM az SGLT1 gén mutációinak köszönhető, és e mutációk többsége vagy csonka SGLT1 fehérjét, vagy a transzporter sejtben való helytelen mozgását eredményezi. Amint az egy autoszomális recesszív betegség esetében várható volt, minden rokonban egy saját mutáció okozza a betegséget, és a betegség gyakorisága megnő azokban a kultúrákban, ahol magas a vérrokonsági házasságok gyakorisága. Bár a GGM ritka, lehetséges, hogy az enyhe SGLT1-mutációt vagy az egyik allél súlyos mutációját hordozó egyének nagyobb csoportjánál a glükóz- és galaktózfelszívódás károsodott. A normál populáció, az orvostanhallgatók mintegy 10%-a adott pozitív glükóz H2 kilégzési tesztet (14). Ez a fiziológia és a betegség közötti kapcsolódási pont nemcsak a cukorfelszívódás patofiziológiájának megértését növelte, hanem új megközelítéseket biztosított a Na+ és a cukor plazmamembránokon keresztüli transzportja közötti kapcsolat molekuláris mechanizmusainak vizsgálatához.

FOOTNOTES

• * A membrántranszport genetikai rendellenességeiről szóló meghívásos cikksorozat első darabja.

.