Immunfestés

ImmunhisztokémiaSzerkesztés

Főcikk: Immunhisztokémia

Az immunhisztokémia vagy a szövetmetszetek IHC festése (vagy immuncitokémia, ami a sejtek festését jelenti), talán a leggyakrabban alkalmazott immunfestési technika. Míg az IHC-festés első eseteiben fluoreszcens festékeket használtak (lásd immunfluoreszcencia), ma már más, nem fluoreszcens, enzimeket, például peroxidázt (lásd immunoperoxidáz festés) és alkalikus foszfatázt használó módszereket is alkalmaznak. Ezek az enzimek olyan reakciókat képesek katalizálni, amelyek fénymikroszkópiával könnyen kimutatható színes terméket eredményeznek. Alternatívaként radioaktív elemek is használhatók jelölőként, és az immunreakció autoradiográfiával láthatóvá tehető.

A szövetek előkészítése vagy rögzítése elengedhetetlen a sejtmorfológia és a szöveti architektúra megőrzéséhez. A nem megfelelő vagy elhúzódó fixálás jelentősen csökkentheti az antitestkötő képességet. Számos antigén sikeresen kimutatható formalinban fixált, paraffinba ágyazott szöveti metszeteken. Néhány antigén azonban még a mérsékelt mennyiségű aldehidfixálást sem éli túl. Ilyen körülmények között a szöveteket gyorsan frissen kell fagyasztani folyékony nitrogénben, és kriosztáttal kell vágni. A fagyasztott metszetek hátrányai közé tartozik a rossz morfológia, a rossz felbontás nagyobb nagyításoknál, a paraffinmetszeteken való átvágás nehézsége és a fagyasztott tárolás szükségessége. Alternatívaként a vibratomos metszetek nem igénylik, hogy a szövetet szerves oldószerekkel vagy magas hővel dolgozzák fel, ami elpusztíthatja az antigenitást, vagy fagyasztva felolvasztással megzavarják. A vibratomos metszetek hátránya, hogy a metszési folyamat lassú és nehézkes a puha és rosszul rögzített szövetek esetében, és hogy a metszeteken gyakran láthatóak a rázónyomok vagy vibratomos vonalak.

Számos antigén kimutatása drámaian javítható az antigén-visszanyerő módszerekkel, amelyek a fixálás során kialakult fehérje-keresztkötések egy részének felbontásával hatnak, és így feltárják a rejtett antigénhelyeket. Ezt különböző ideig tartó melegítéssel (hővel indukált epitóp visszanyerés vagy HIER) vagy enzimes emésztéssel (proteolitikus indukált epitóp visszanyerés vagy PIER) lehet elérni.

Az IHC festés egyik fő nehézsége a specifikus vagy nem specifikus háttér leküzdése. A fixálási módszerek és idők optimalizálása, a blokkolószerekkel történő előkezelés, az antitestek nagy sóval történő inkubálása, valamint az antitestek utáni mosópufferek és mosási idők optimalizálása mind fontosak a jó minőségű immunfestés eléréséhez. Emellett a festés pozitív és negatív kontrolljainak jelenléte elengedhetetlen a specificitás meghatározásához.

Áramlási citometriaSzerkesztés

Főcikk: Áramlási citometria

Az áramlási citométer egy vagy több specifikus fehérjét expresszáló sejtek közvetlen elemzésére használható. A sejteket oldatban immunfestik az immunfluoreszcenciához hasonló módszerekkel, majd áramlási citometriával elemzik.

Az áramlási citometria számos előnnyel rendelkezik az IHC-vel szemben, többek között: a méretük és szemcsézettségük alapján elkülönülő sejtpopulációk meghatározásának képessége; az elhalt sejtek kizárásának képessége; jobb érzékenység; és több színű elemzés több antigén egyidejű méréséhez. Az áramlási citometria azonban kevésbé hatékony lehet a rendkívül ritka sejtpopulációk kimutatásában, és szöveti metszet hiányában az architekturális kapcsolatok elvesznek. Az áramlási citometria emellett magas tőkeköltséggel jár az áramlási citométer megvásárlásával kapcsolatban.

Western blottingSzerkesztés

Főcikk: Western blot

A Western blotting lehetővé teszi specifikus fehérjék kimutatását sejtekből vagy szövetekből készült kivonatokból, a tisztítási lépések előtt vagy után. A fehérjéket általában gélelektroforézissel méret szerint választják el, mielőtt száraz, félszáraz vagy nedves blotting módszerekkel szintetikus membránra viszik át. A membrán ezután az immunhisztokémiához hasonló módszerekkel, de fixálás nélkül, antitestekkel vizsgálható. A kimutatás jellemzően peroxidázzal kapcsolt antitestek segítségével történik, amelyek egy kemilumineszcens reakciót katalizálnak.

A western blotting egy rutin molekuláris biológiai módszer, amely félkvantitatív módon használható az egyes kivonatok fehérjeszintjeinek összehasonlítására. A blottingot megelőző méretszeparáció lehetővé teszi a fehérje molekulatömegének mérését ismert molekulatömegű markerekkel összehasonlítva.

Enzyme-linked immunosorbent assaySzerkesztés

Főcikk: ELISA

Az enzimhez kötött immunszorbent assay vagy ELISA egy diagnosztikai módszer a fehérjekoncentrációk kvantitatív vagy félkvantitatív meghatározására vérplazmából, szérumból vagy sejt-/szövetkivonatokból, több lyukú lemez formátumban (általában 96 lyukú lemezenként). Általánosságban elmondható, hogy az oldatban lévő fehérjéket ELISA-lemezekre adszorbeálják. Az érdeklődésre számot tartó fehérjére specifikus antitesteket használnak a lemez szondázására. A háttér minimalizálása a blokkolási és mosási módszerek optimalizálásával történik (mint az IHC esetében), a specifitást pedig a pozitív és negatív kontrollok jelenléte biztosítja. A kimutatási módszerek általában kolorimetrikus vagy kemilumineszcencia alapúak.

Immun-elektronmikroszkópiaSzerkesztés

Főcikk: Immun-elektronmikroszkópia

Az elektronmikroszkópia vagy EM a szövetek vagy sejtek részletes mikroarchitektúrájának vizsgálatára használható. Az immun-EM lehetővé teszi specifikus fehérjék kimutatását ultravékony szöveti metszetekben. A nehézfém részecskékkel (pl. arannyal) jelölt antitestek transzmissziós elektronmikroszkópiával közvetlenül láthatóvá tehetők. Bár az immun-EM nagy teljesítményt nyújt a fehérjék szubcelluláris lokalizációjának kimutatásában, technikailag nagy kihívást jelent, költséges lehet, és a szövetek rögzítési és feldolgozási módszereinek szigorú optimalizálását igényli. A fehérjék in vivo biotinilálását azért javasolták, hogy enyhítsék az antitestfestés és a sejtmorfológiát jobban megőrző fixálási protokollok gyakori inkompatibilitásából adódó problémákat.

Vélemény, hozzászólás?

Az e-mail-címet nem tesszük közzé.